題目：探索沙棘種子乙酸乙酯提取物作為天然愈合劑促進傷口修復(fù)的潛在機制

英文名：Exploring the potential mechanisms of the ethyl acetate fraction of Hippophae rhamnoides L. seeds as a natural healing agent for wound repair

雜志：JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY

影響因子：4.8/Q1

發(fā)表時間：2024年8月13日

研究背景：沙棘（HippophaerhamnoidesL.）因其營養(yǎng)價值而被中國國家衛(wèi)生委員會指定為“藥食同源”水果。在中國傳統(tǒng)民族醫(yī)藥中，沙棘常用于治療燒傷、潰瘍和胃潰瘍等不愈合傷口。本研究旨在探討沙棘籽乙酸乙酯提取物（SBS-EF）對燒傷傷口的愈合作用。這項研究的主要目的是確定沙棘籽（SBS）治療燒傷最有效的藥用部位，并研究其治療效果的物質(zhì)基礎(chǔ)和機制。

研究思路：通過MTT試驗、劃痕試驗、透孔試驗和羥脯氨酸分泌分析，評估了SBS-EF不同成分對人皮膚成纖維細胞（HSFs）增殖和遷移的影響。在所有提取物中，SBS-EF的活性highest。隨后的分析包括網(wǎng)絡(luò)藥理學方法、分子對接研究、超高效液相色譜和嚴重二度燒傷大鼠模型，以研究SBS-EF的化學成分和潛在治療機制。

研究結(jié)果：

1、體外篩選SBS中Most藥用價值的部分

1.1 SBS-EF促進HSF細胞增殖

為了確定SBS提取物對HSFs的影響，通過MTT試驗評估了細胞活力。與對照組相比，在6.25至100μg/mL的藥物濃度范圍內(nèi)，SBS-PF、SBS-EE或SBS-AE組的細胞活性沒有明顯變化。然而，當SBS-EF濃度為100μg/mL時，細胞活性明顯增加（P<0.01）（圖1），表明該濃度的SBS-EF能有效增加細胞活性。

圖1

1.2 傷口劃痕試驗

劃痕試驗結(jié)果表明，SBS-PF、SBS-EE、SBS-AE和SBS-EF在25至50μg/mL的濃度范圍內(nèi)，培養(yǎng)24小時后在一定程度上促進了HSF細胞的遷移。特別是，用50μg/mLSBS-EF處理的細胞遷移率為65.6%，表明SBS-EF顯著增強了細胞遷移（P<0.01，圖2）。

圖2

1.3 傷口轉(zhuǎn)孔試驗

transwell 實驗結(jié)果表明，SBS-EF影響了細胞遷移，因為與SBS-PF、SBS-EE和SBS-AE相比，SBS-EF組有更多的細胞穿過膜（P<0.01，圖3）。此外，在劃痕試驗和Transwell試驗中，暴露于SBS-EF會明顯促進細胞的平行和垂直遷移。

圖3

1.4 細胞內(nèi)羥脯氨酸測定

此外，羥脯氨酸測定結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)濃度為12.5至50μg/mL的SBS-EF處理后，HSFs分泌的羥脯氨酸明顯增加（P<0.01，圖4）。與暴露于SBS-PF、SBS-EE和SBS-AE的細胞分泌的羥脯氨酸相比，暴露于SBS-EF的細胞分泌的羥脯氨酸明顯更多。

圖4

2、確定SBS-EF的成分

質(zhì)譜指紋圖譜顯示，10種具有不同保留時間、質(zhì)量和碎片模式的化合物的數(shù)據(jù)與在線數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相吻合。參照相關(guān)文獻對這些數(shù)據(jù)進行了驗證。(圖5）。

圖5

3、網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

利用來自這10種化學成分的UPLC-Orbitrap-Exploris-120MS數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)庫篩選確定了82個相關(guān)靶標，并通過從燒傷數(shù)據(jù)庫中篩選疾病相關(guān)靶標，在去除重復(fù)條目后確定了4451個相關(guān)靶標。通過網(wǎng)上提供的維恩圖對SBS-EF的化學成分和疾病靶點重疊部分進行分析，最終確定了150個共享靶點。在Cytoscape3.6.0中組裝了成分-靶標網(wǎng)絡(luò)，并對主要靶標進行了（PPI）分析。結(jié)果表明，根據(jù)用于治療燒傷的SBS-EF濃度，TNF（89）、IL-6（89）、AKT1（88）、SRC（77）和表皮生長因子受體（70）是主要的核心靶標，核受體GSK-3β（50）也被認為是一個重要靶標。利用KEGG數(shù)據(jù)庫進一步研究了程度值超過平均值（20）的五十七個核心靶點，揭示了它們的治療效果與VEGF信號通路、糖尿病疾病中的AGE-RAGE信號通路和HIF-1信號通路之間的潛在相關(guān)性（圖6）。

圖6

4、分子對接研究

通過全面查閱文獻并利用基于網(wǎng)絡(luò)的藥理分析工具，對參與Wnt/β-catenin信號通路的Wnt3A、β-catenin、GSK-3β、APC、AXIN、FRIZZLED和LRP5/6蛋白與八種不同化合物進行了分子對接分析。由此確定的結(jié)合能如下：異鼠李素與β-catenin（PDB：7ZRB）、APC（PDB：4YK6）和AXIN（PDB：7Y1P）之間的親和力分別為分別為-71.49kcal/mol、-33.34kcal/mol和-67.43kcal/mol（圖7B-F和圖7G），山奈酚與Wnt3a（PDB：8TZR）、GSK-3β（PDB：5aIR）和LR5P/6（PDB：7NAM）之間的關(guān)系為分別為-54.84kcal/mol和-66.58kcal/mol（圖7A-C和E）。結(jié)合能低于-7kcal/mol表明結(jié)合活性顯著。利用DiscoveryStudio2023對分子相互作用進行了直觀檢查。

圖7

5、SBS-EF對傷口愈合的影響

愈合率是評估燒傷創(chuàng)面恢復(fù)情況的關(guān)鍵指標。為了進一步檢驗SBSEF治療大鼠燒傷的療效，我們在第0、3、7、14和21天觀察了大鼠皮膚的愈合進展。第0、3、7、14和21天，SBS-EF的傷口愈合率分別為17%、20%和45%。模型組為20%、41%和72%；SBS-EF-L組為21%、在7d、14d和21d時，SBS-EF-H組的傷口愈合率分別為67%和87%。SBS-EF-L組和SBS-EF-H組的傷口愈合率明顯高于模型組（P<0.05，P<0.01，圖8A）。與模型組相比，SBS-EF-L組21d時的皮膚水合度也顯著降低（P<0.05，圖8B）。同樣，與其他組相比，SBS-EF-H在第14天和第21天導(dǎo)致皮膚水分含量大幅下降（P<0.01）。此外，與模型組相比，SBS-EF-H組燒傷皮膚的羥脯氨酸水平明顯增加（P<0.01，圖8C）。

圖8

6、SBS-EF在傷口修復(fù)過程中引發(fā)的組織病理學變化

一般來說，在皮膚恢復(fù)的整個過程中，膠原蛋白的正確排列和重組可增強皮膚的彈性和拉伸強度，最終減少疤痕。在愈合過程中，傷口內(nèi)膠原纖維的戰(zhàn)略排列對于減少疤痕組織和提高再生組織的質(zhì)量至關(guān)重要。對模型組愈合過程的組織病理學檢查顯示，燒傷21d后愈合嚴重延遲。愈合延遲的原因是存在一個沒有上皮細胞形成的大痂（圖9A）。Masson染色顯示，對照組的膠原纖維組織良好，而模型組的膠原纖維結(jié)構(gòu)混亂，膠原蛋白生成減少。然而，真皮組織中膠原纖維的排列、生成和配置都有明顯改善，特別是在SBS-EF-H組（圖9B）。

圖9

7、激活Wnt/β-catenin信號通路可促進傷口修復(fù)過程

為了探討SBS-EF對皮膚傷口愈合的影響，進行了Western印跡分析，以量化Wnt3a、β-catenin和GSK-3β蛋白水平。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組的Wnt3a蛋白水平明顯升高（P<0.05）。此外，與對照組相比，SBS-EF-H組的Wnt3a蛋白水平明顯升高圖10B）。模型組的β-catenin蛋白水平也明顯高于對照組（P＜0.05），SBS-EF-H組高于模型組（P＜0.05，圖10C）。使用SBS-EF后，蛋白質(zhì)Wnt3a和β-catenin明顯上調(diào)，磷酸化GSK-3β的表達水平明顯降低（圖10A和D）。

圖10

總結(jié)：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學+分子對接的綜合研究，并進行了驗證，為SBS-EF通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路治療燒傷提供了新的見解！傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗證、機制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！