題目：探索葛根在肥胖調(diào)節(jié)中的作用

英文名：Exploring the mechanism of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi in the regulation of obesity

雜志：Journal Of Ethnopharmacology

影響因子：4.8/Q1

發(fā)表時(shí)間：2024年8月16日

研究背景：葛根（PR）富含黃酮類、三萜類、皂苷、多糖等化學(xué)成分。肥胖和各種慢性疾病不僅對人們的健康構(gòu)成巨大威脅，而且給人們帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療投入。目前研究表明，葛根具有降低血糖、改善胰島素敏感性和抑制肥胖的作用。然而，葛根抑制肥胖的具體機(jī)制尚不清楚，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合來研究葛根抗肥胖作用的研究較少。

研究思路：本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究PR的治療效果和作用機(jī)制。通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫，共篩選出6種主要化學(xué)成分和257個(gè)潛在靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)相互作用分析表明，AIfT1、AKR1B1、PPARG、MMP9、TNF、TP53、BAD和BCL2是核心靶點(diǎn)。富集分析表明，PR在預(yù)防肥胖方面的作用途徑涉及癌癥信號通路和PI3K-Akt信號通路，它們可能是主要的作用途徑。進(jìn)一步的分子對接驗(yàn)證表明，其核心目標(biāo)物與4種化合物具有良好的結(jié)合活性：formononectin、purerin、7,8,4,-trihydroxide和大豆黃素。利用超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）技術(shù)檢測并確認(rèn)了這些主要化合物。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素以濃度依賴性方式抑制細(xì)胞增殖和分化，顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡并影響細(xì)胞遷移。動物實(shí)驗(yàn)表明，葛根素能減少小鼠的食物攝入量和體重增加。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能上調(diào)高密度脂蛋白（HDL），下調(diào)總膽固醇（TC）、總膽固醇（TG）和低密度脂蛋白（LDL）等血液生化指標(biāo)。Western印跡結(jié)果表明，葛根素能顯著抑制AKT1、AKR1B1、MMP9、TNF、TP53、BCL2、PPARG ，并在細(xì)胞和動物水平上顯著增加BAD蛋白的表達(dá)。

圖1

研究結(jié)果：

1、PR活性成分的篩選和靶點(diǎn)信息分析

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索 PR 的有效成分和相應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息。篩選出6種活性化合物：谷氨酰葡萄糖、甲醛素、β-谷甾醇、3'-甲氧基黃苷元、purerin和7,8,4'-三氫氧化物異黃酮。

2、預(yù)測潛在作用靶點(diǎn)，構(gòu)建抗肥胖PR有效成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過SwissTarget預(yù)測平臺，得到了431個(gè)作用靶點(diǎn)。從GeneCards等數(shù)據(jù)庫中共檢索并整合了1521個(gè)肥胖癥靶點(diǎn)。PR的活性成分和肥胖癥共有靶點(diǎn)257個(gè)（圖2A）。利用Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化，然后得到PR、有效成分和目標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)圖（圖2B）。

圖2

3、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

將257個(gè)常見靶標(biāo)上傳到STRING，并使用Cytoscape3.7.2軟件對靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分析，得到PPI（圖2C）。其中有8個(gè)靶標(biāo)超過了平均度值，推測這8個(gè)靶點(diǎn)是肥胖癥PR的主要靶點(diǎn)。從這8個(gè)靶點(diǎn)可以看出，許多物質(zhì)，如轉(zhuǎn)錄因子、信號分子、受體、蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白）和酶（激酶、轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶）都參與了肥胖癥的預(yù)防和治療。其中，AItT1、AItR1B1、PPARG、MMP9、TNF、TP53、BAD和BCL2的節(jié)點(diǎn)度值排名前8位。這些靶點(diǎn)可能是肥胖癥治療的主要靶點(diǎn)。然后使用Cytoscape3.7.2軟件對核心靶蛋白進(jìn)行分析，得到前8個(gè)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2D）。

4、GO和KEGG富集分析

GO富集分析結(jié)果表明，BP主要參與PR的抗肥胖靶標(biāo)，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等。CC主要分布在質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、胞漿等部位。CC主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、同種蛋白結(jié)合等（圖3A）。

KEGG通路分析的結(jié)果表明，PR 治療肥胖的靶點(diǎn)主要集中在癌癥中的通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、前列腺癌、氮代謝、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、雌激素信號通路、內(nèi)分泌抵抗等通路（圖3B），一些關(guān)鍵靶基因分別與腫瘤信號通路（圖3C）和PI3K-AKT信號通路（圖3D）相關(guān)，并覆蓋在肥胖的調(diào)控中。

圖3

5、分子對接驗(yàn)證結(jié)果

圖4顯示了6個(gè)化合物與肥胖癥核心靶標(biāo)的分子對接模式。對接結(jié)果顯示，purerin 與 AKT1 蛋白的氨基酸殘基 ARG-25 、 SER-56 和 GLU-9 形成氫鍵 （圖4A）；Daidzein與BAD蛋白的氨基酸殘基ARG-55、SER-22和SER-29形成氫鍵（圖4B）；ALA-113和BAD蛋白的SER-47形成氫鍵（圖4C）；Purerin與BAD蛋白的氨基酸殘基SER-22和ASN-162形成氫鍵（圖4D）；Daidzein與AItR1BI蛋白形成疏水作用（圖4E）；Formononetin與BAD蛋白的氨基酸殘基GLN-183形成氫鍵（圖4F）。7,8,4′-疏水性異黃酮與AKR1B1蛋白相互作用（圖4G）;Purerin與AKR1B1蛋白的氨基酸殘基PRO-261和GLU-271形成氫鍵（圖4H）;黃豆苷元和BCL-2蛋白之間形成疏水相互作用（圖4I）;Purerin與BCL-2蛋白HIS-143、GLU-113和SER-49的氨基酸殘基形成氫鍵（圖4J）;Purerin與TP53蛋白的氨基酸殘基LYS-51、ASN-37和SER-18形成氫鍵（圖4K）;Formononetin與MMP-9蛋白的氨基酸殘基SER-32形成氫鍵（圖4L）;葛根素與MMP-9蛋白的氨基酸殘基ARG-17和ARG-22形成氫鍵（圖4M）;黃豆苷元與PPARG蛋白的氨基酸殘基GLU-343形成氫鍵（圖4N）;7,8,4′-三羥基異黃酮與PPARG蛋白的GLY-346和ARG-280形成氫鍵（圖4O）;Purerin與PPARG蛋白的氨基酸殘基SER-342、GLU-343和PHE-282形成氫鍵（圖4P）;黃豆苷元和TNF蛋白之間的疏水相互作用（圖4Q）;Formononetin與TNF蛋白形成疏水相互作用（圖4R）;葛根素和TNF蛋白形成疏水相互作用（圖4S）。

圖4

基于PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇了度數(shù)前8名的核心靶基因與葛根素進(jìn)行分子對接。TNF的LibDock評分為108.676（圖5a），AKT1的LibDock評分為106.146（圖5B），AKR1B1的評分為93.0223（圖5C），BAD的評分為79.2118（圖5D），BCL2的評分為78.982（圖5E），MMP9的評分為105.4866（圖5F），PPARG的評分為79.2118（圖5 F）G）的對接評分為109.9212，與TP53結(jié)合的LibDock評分為106.189（圖5H），葛根素與肥胖相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合相對較好。

圖5

6、¹H-NMR,¹³C-NMR,UPLC-MS和GC-MS結(jié)果

圖中顯示了正離子模式（圖6A）和負(fù)離子模式（圖6B）下 PR 樣品的典型總離子色譜圖。共有37種化合物。通過分析UPLC-MS和GC-MS數(shù)據(jù)，確定了上述源自 PR 的6個(gè)成分。

圖6

7、基于3T3-L1脂肪細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

7.1、葛根素對3T3-LI細(xì)胞活力的影響

圖7A顯示了4種活性PR化合物的二維結(jié)構(gòu)圖。圖7B為PP中LibDock得分highest的化合物（葛根素）的三維結(jié)構(gòu)圖。為了研究葛根素對3T3-LI細(xì)胞活性的影響，本研究比較了加入或不加入不同濃度的葛根素（50、100、200、400、800和1000mg/L）和不同濃度的奧利司他陽性藥物（50和100mg/L）后的對照組。發(fā)現(xiàn)葛根素以劑量依賴的方式降低了3T3-LI前脂肪細(xì)胞的活性，這與陽性藥物的趨勢一致（圖7C）。

圖7

7.2、葛根素對3T3-LI前脂肪細(xì)胞劃痕生長率的影

為探討葛根素對3T3-LI細(xì)胞遷移率的影響，通過細(xì)胞劃痕水平驗(yàn)證葛根素對細(xì)胞劃痕愈合程度的影響，并對干預(yù)后12、24h分別添加或不添加不同濃度葛根素（50、100、200mgJL）和50mg/L奧利司他陽性藥物的劃痕傷口愈合程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖8）。藥物治療12h后，葛根素50、100和200mgJL治療組的劃痕愈合率分別為34.82%、33.88%和26.93%，陽性藥物組的劃痕愈合率為24.47%。24小時(shí)后，50、100和200mgJL治療組葛根素的劃痕愈合率分別為66.23%、58.74%和51.63%，陽性藥物組的劃痕愈合率為56.31%。結(jié)果表明，葛根素對細(xì)胞遷移有一定的抑制作用，其劑量依賴性與陽性藥物組相同。

圖8

7.3、葛根素對3T3-LI前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞凋亡結(jié)果

通過檢測葛根素對細(xì)胞凋亡的影響，驗(yàn)證了葛根素對3T3-LI細(xì)胞活力的影響（圖9）。與對照組相比，不同濃度（50、100和200mg/L）的葛根素和50mg/L奧利司他陽性藥物的細(xì)胞凋亡率分別為12.31%、14.30%和19.00%。隨著劑量的增加，葛根素對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用相同，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡的趨勢呈上升趨勢，說明葛根素能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖9

7.4、葛根素對3T3-LI前脂肪細(xì)胞的油紅O染色結(jié)果

為了確定葛根素是否具有抑制成脂分化的作用，本研究對添加或不添加不同濃度（50、100、200mgJL）葛根素的細(xì)胞進(jìn)行了油紅O染色，并設(shè)立了藥物干預(yù)陽性組。與完全分化的脂肪細(xì)胞相比，葛根素劑量依賴性地抑制了3T3-LI細(xì)胞在第3、6和9天的脂滴生成（圖10）。第9天的抑制效果更明顯，且抑制效果優(yōu)于陽性藥物。因此，葛根素可減少3T3-LI細(xì)胞脂肪分化過程中的脂質(zhì)積累。

圖10

7.5、葛根素對相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

與對照組相比，模型組AKR1B1（圖11A）、AKT1（圖11B）、BCL2（圖11C）、MMP9（圖11D）、PPARG（圖11E）、TNF（圖11F）和TP53（圖11G）蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而BAD的表達(dá)水平（圖11H）蛋白顯著降低（P <0.05）。與模型組相比，給藥組AKT1、AKR1B1、PPARG、MMP9、TNF、TP53和BCL2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P <0.05），而BAD蛋白表達(dá)水平顯著升高（P <0.05）。

圖11

8、體內(nèi)食物攝入量和體重的結(jié)果

在研究結(jié)束時(shí)（第9周），與其他組相比，實(shí)驗(yàn)組之間的食物攝入量有所減少，如圖 12B.NC：第1周20.849，第9周26.065，增加25.02%HFD：第1周20.609，第9周36.134，增加75.33%PUE：第1周20.456，第9周27.166，增加32.80%ORL：第1周20.905，第9周31.647，增加51.38%。所有小鼠的體重變化如圖 12A所示。NC組小鼠體重增加了25.02%，而高脂飲食喂養(yǎng)的動物體重增加了75.33%，顯著高于NC組。然而，PUE組小鼠的體重僅比初始體重增加了32.80%，顯著低于HFD組。這表明PUE干預(yù)可以降低體重增加的速度。

圖12

9、體內(nèi)蘇木精和伊紅染色結(jié)果

分別對脂肪組織和肝組織進(jìn)行了蘇木精和伊紅（H&E）染色。脂肪組織的染色結(jié)果表明，補(bǔ)充葛根素可以縮小脂肪細(xì)胞的體積。圖12D顯示，葛根素處理組小鼠的細(xì)胞體積與對照組相同，而高脂飲食組小鼠的細(xì)胞體積均與對照組相同。此外，葛根素處理還減少了大中型脂肪細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)，肝臟的H&E染色（圖12C）顯示，喂食高脂飲食的小鼠肝臟中有脂滴，而葛根素能有效緩解酒精和高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累。H&E染色顯示肝組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重異常，空泡化嚴(yán)重。肝臟組織中一些肝細(xì)胞排列稀疏，少數(shù)肝細(xì)胞水腫。一些炎性細(xì)胞也有浸潤。PUE干預(yù)后，這些癥狀明顯緩解。

10、體內(nèi)生化分析結(jié)果

體內(nèi)生化分析結(jié)果如圖 12E所示，HFD組血清甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平顯著高于NC組。與HFD組相比，PUE組血脂水平顯著降低。從血清總甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）4項(xiàng)血脂指標(biāo)觀察葛根素的調(diào)節(jié)功能，差異顯著，呈改善趨勢。

11、體內(nèi)Western印跡檢測結(jié)果

Westernblot結(jié)果顯示，如圖13 所示，與NC組相比，HFD顯著上調(diào)PPARG、BCL2、TNF、AKT、TP53、MMP9、AKR1B1，顯著下調(diào)BAD。與HFD組相比，PUE組顯著改善PPARG、BCL2、TNF、AKT、TP53、MMP9、AKR1B1的上調(diào)和BAD的下調(diào)。

圖13

總結(jié)：本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)+分析對接的方法，預(yù)測了其有效成分及其治療肥胖癥的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)！傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！