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服務(wù)介紹：

用標(biāo)記的特異性抗體，對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量，進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）技術(shù)。

本實驗是將組織細(xì)胞內(nèi)的抗原可視化過程，可直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上原位顯示某些蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，并可精確到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平。載玻片上的組織細(xì)胞經(jīng)過預(yù)處理（脫蠟至水、抗原修復(fù)等）后，孵育相應(yīng)的抗體，此時抗原（多肽、蛋白質(zhì)、外源性物質(zhì)等）被第一抗體特異性識別結(jié)合，然后把第一抗體作為抗原繼續(xù)通過第二抗體特異性識別結(jié)合（第二抗體上有標(biāo)記特定物質(zhì)），若第二抗體標(biāo)記的特定物質(zhì)為辣根過氧化物酶（HRP），可與DAB在特定條件下反應(yīng)形成棕褐色沉淀，最后通過顯微鏡觀察。

主要用途：

免疫組織化學(xué)技術(shù)可借助顯微鏡的顯像與放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、酶、激素、病原體及受體等）。在病理學(xué)中，免疫組化技術(shù)常用來進(jìn)行腫瘤的診斷及鑒別診斷，也可通過此技術(shù)對腫瘤進(jìn)行更細(xì)化的分類。

檢測原理：

根據(jù)抗原抗體反應(yīng)（即抗原抗體特異性結(jié)合）和化學(xué)顯色原理，引入附有標(biāo)記物的外源性抗體（或抗原），使之錨定于組織或細(xì)胞標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（或抗體），標(biāo)記物經(jīng)呈色反應(yīng)來顯示待檢抗原（或抗體）。

實驗流程：

脫蠟與水化-抗原修復(fù)-滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素-血清封閉-孵育一抗-孵育二抗-DAB顯色-蘇木素復(fù)染-脫水與透明-封片-顯微鏡鏡檢。

樣本要求及運(yùn)輸條件：

1、提供固定合格的樣本。組織離體后，選擇合適的固定液立即固定，固定液的量建議大于組織體積的10-15倍，新鮮標(biāo)本用合適的容器固定24-48h，大標(biāo)本固定12h，再切開固定。標(biāo)本常溫（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷凍結(jié)冰，固定樣本常溫運(yùn)輸送樣。

2、涂片和爬片必須充分固定，石蠟切片實驗前需充分脫蠟。

3、提供準(zhǔn)確的抗體信息。

實驗結(jié)果:

免疫組化常見問題解答:

1）產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？ 如何解決？

1 、 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是 最重要的一條。

2 、 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加 滅活劑濃度來降低背景染色；

4 、 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；

5 、 DAB 孵育時間過長或濃度過高；

6 、 PBS 沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色， 在一抗/二抗/SP 孵育后的浸洗尤為重要；

7 、 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

2）免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？

1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和 后帶效應(yīng)， 必須摸索最佳濃度。

2、抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合； 建議微波修復(fù) 用高火 4 次*6min 試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數(shù)。若不行， 還可高壓修復(fù)。

3、組織切片本身這種抗原含量低。

4 、血清封閉時間過長。

5 、DAB 孵育時間過短。

6 、細(xì)胞通透不全， 抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

7、開始做免疫組化，建議一定要首先做個陽性對照片， 排除抗體等問題。

3）石蠟切片和冰凍切片的比較？

1 、要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片。因為做石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織 的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。

2 、冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易 形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時， 目 錄上都寫著做什么樣的切片， 如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。

3 、石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80 度的 低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止 RNA  降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到 4 微米左右， 所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。

4）如何選擇一抗？

1 、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一 的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由 好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特 異性強(qiáng)，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低； 而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高， 但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

2 、應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于 Western  blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至標(biāo)明石蠟切 片或冰凍切片。

3 、種屬反應(yīng)性的選擇（species reactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測 哪種種屬動物體內(nèi)的抗原。

4 、種屬來源，一般兔來源的多是多克隆抗體；而小鼠來源的多是單克隆抗體，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相 應(yīng)的二抗。

5 、生產(chǎn)廠家的選擇。

5）在什么情況下使用 TritonX-100？

1 、Triton X-100 化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(>10um 厚切片)  和免疫細(xì)胞化學(xué) 中一般用 Triton X-100  作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。

2 、其作用原理： Triton X-100  可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞 漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。

3 、Triton X-100 既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。

6）封閉血清的選擇原則是什么？

1 、膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體， 造成后續(xù)結(jié)果的假陽性。

2 、封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體， 預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合， 否 則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會造成背景。

3 、也可以用小牛血清、 BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。

7）抗體孵育條件的比較？

1 、一抗孵育溫度有幾種：4 度、室溫、 37 度，其中4 度效果最佳；孵育時間： 這與溫度、抗體濃度有關(guān)， 一般 37 度 1-2h ，4 度過夜（從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min）。

2 、二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時間需要摸索。

8）一抗 4 度孵育后為什么要進(jìn)行 37 度復(fù)溫？

1 、一方面，防止切片從 4 度直接放入 PBS 易脫片；

2、另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 度和 37 度時分子運(yùn)動方式不同, 前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

9）DAB 顯色時間如何把握？

1 、DAB 顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間， 到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗；

2 、DAB  顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間 過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；

3 、此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全， 需要延長封閉時間；

4 、DAB 顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最 好一抗 4 度過夜）； 另一方面就是封閉時間過長。

10）免疫組化結(jié)果如何分析？

1 、陽性著色細(xì)胞計數(shù)法。在 40×光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的 10 個視野，人工或機(jī)器計數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組 3~6 張不同動物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。

2 、灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image  j 進(jìn)行灰密度分析， 然后進(jìn)行統(tǒng)計分析即可。

3 、評分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3 分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽 性范圍進(jìn)行評分（1~4 分為 0~25% 、26~50% 、51~75% 、76~100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加， 再進(jìn)行比較。

對于以上這幾種方法，各有利弊，請細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量 切片。

11）在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)， 抗原修復(fù)的條件是什么？

1 、由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。 通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。

2 、修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種， 高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相 關(guān)資料，大量的：中性的、高 pH 的等）。

3 、微波修復(fù)，一般用 6min*4 次，效果不錯。

12） 內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？

1、一般 3%過氧化氫滅活時間短點(diǎn)，可以 10min 左右；而 0.3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時間，一般 10~30min。

2 、用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或 PBS 可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片.

3 、現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4 度避光保存。

13）如何才能充分脫蠟？

1 、蠟不溶于水， 如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現(xiàn)、真假難辨、背 景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯， 因它脫蠟

力強(qiáng)，脫蠟時間較短；

2 、脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮， 則脫蠟 時間不需很多，3-5 分鐘就已足夠。如果在冬天， 室溫較低， 脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長， 10-20 分鐘 或更長。

3 、當(dāng)天切的切片， 燒烤 2  小時后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的 切片，在染色前，還必須對切片進(jìn)行加溫 10-20 分鐘，然后再行脫蠟， 這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。

總之，操作時應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要徹底、干凈、完全地 脫去切片上的蠟。

14）如何最大限度地降低組織非特異性染色？

1 、縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。

2 、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3 、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加 滅活劑濃度來降低背景染色；

4、非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；

5 、縮短 DAB 孵育時間或降低 DAB 濃度/過氧化氫濃度等；

6 、適當(dāng)增加 PBS 沖洗次數(shù)和浸洗時間，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤為重要；

7 、防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

15）背景染色較深的原因有哪些？

1、抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試， 使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度， 既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書 進(jìn)行染色。

2 、抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是， 嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程， 最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒， 避免因遺忘而造成時間延長。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的 1 小時， 而是 30 分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

3、DAB 變質(zhì)和顯色時間太長：DAB 最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的 DAB 不應(yīng)存放時間太長， 因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與 DAB 產(chǎn)生反應(yīng)而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰 箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB 的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時立即終 止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機(jī)時， 這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進(jìn)行監(jiān) 控，避免顯色時間過長。

4 、組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補(bǔ)充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變 干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用 DAKO 筆或 PAP  Pen 在組織周圍畫圈， 可以有效的避免液體流失， 也能提高操作速度。

5 、切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于 24  小時）：原因上不清楚， 但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天 將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在 4oC 冰箱過夜，對結(jié)果 無明顯影響，如果放在室溫， 特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此， 不可存放時間太長。

6 、一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期， 過期的抗體要么不顯色要么背景著色。用新買抗體時最 好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。