題目：整合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示麝香保心丸抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制

英文名：Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of Shexiang Baoxin pill against atherosclerosis

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7/Q1

發(fā)表時(shí)間：2024年10月11日

研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化是一種以血管內(nèi)皮發(fā)生脂質(zhì)病變?yōu)樘卣鞯募膊。匀皇菍?dǎo)致全球死亡的一個(gè)主要因素。麝香保心丸（SBP）已被用于治療多種心血管疾病，但其復(fù)雜的作用機(jī)制仍不清楚。本研究旨在確定射香保心丸對動(dòng)脈粥樣硬化的潛在影響以及相關(guān)的潛在調(diào)控機(jī)制。

研究思路：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測藥物-疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并應(yīng)用非靶點(diǎn)代謝組學(xué)分析鑒定關(guān)鍵代謝物和代謝途徑。構(gòu)建小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型以明確SBP對動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用，并進(jìn)行體內(nèi)和體外試驗(yàn)以驗(yàn)證分析結(jié)果和明確SBP影響動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。結(jié)果顯示結(jié)果表明，SBP在體內(nèi)可通過降低血脂水平、斑塊形成和內(nèi)皮損傷發(fā)揮保護(hù)作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)顯示，MAPK3、AKT1和STAT3是樞紐靶點(diǎn)，三甲胺正氧化物（TMAO）是關(guān)鍵代謝物。由于TMAO具有致動(dòng)脈粥樣硬化的作用，因此研究人員在體外研究了SBP的相應(yīng)保護(hù)作用。SBP抑制了TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，并抵消了MAPK3、AKT1和STAT3表達(dá)的上調(diào)。分子對接和酶抑制作用表明，SBP的活性成分能與關(guān)鍵靶蛋白穩(wěn)定結(jié)合。

研究結(jié)果：

1、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

通過SwissADME和SwissTargetPrediction的篩選和預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)了861個(gè)藥物靶點(diǎn)，其中成分與靶點(diǎn)之間的對應(yīng)關(guān)系如圖1A所示。在至少兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中篩選后，確定了843個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化的疾病靶點(diǎn)（圖1B）。藥物與疾病靶點(diǎn)相互作用的維恩圖見圖1C。GO分析顯示，CC項(xiàng)涉及膜筏和局灶粘附，MF項(xiàng)涉及核受體和內(nèi)肽酶活性（圖1D）。根據(jù)KEGG分析結(jié)果，脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡、PI3K-Akt和IL-17信號(hào)通路被強(qiáng)烈富集（圖1E）。

接下來，作者構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選出了中心基因（圖1F）。圖1G中顯示了33個(gè)相關(guān)的TFs，其中關(guān)聯(lián)度highest的是FOXC1、GATA2、YY1、HINFP、USF2、MAX和TFAP2A。在如圖1H所示，基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)由與樞紐基因高度相關(guān)的miRNAs發(fā)揮作用：hsa-mir-19a-3p、hsa-mir-17-5p、hsa-mir-19b-3p、hsa-mir-20a-5p。上述中樞基因、TFs和miRNA可能在動(dòng)脈粥樣硬化中具有潛在的作用，隨后進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果。

圖1

2、SBP對血脂水平和動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響

    在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，每三周記錄一次體重。在每組之間觀察到?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，這表明SBP不會(huì)干擾小鼠的食欲或能量消耗。與模型組相比，治療組在SBP灌飼12周后TC、TG和LDL-C水平顯著降低（圖2A-C）。此外，ALT、AST和Urea水平在組間無顯著差異，表明SBP對小鼠的肝或腎功能沒有影響（圖2D-F）。

圖2

 在組織病理學(xué)方面，最初通過量化主動(dòng)脈斑塊病變的尺寸來檢查SBP對AS的影響。在模型組中，反映主動(dòng)脈粥樣硬化程度的油紅O染色區(qū)域的百分比遠(yuǎn)高于對照組，而SBP抑制了這種變化（圖3A）。此外，主動(dòng)脈根部病變面積和膠原蛋白含量與H&E和Masson染色也是評估AS的關(guān)鍵指標(biāo)，顯示SBP表現(xiàn)出病變面積和膠原蛋白含量增加的顯著逆轉(zhuǎn)（圖3B-C）。因此，這些結(jié)果表明SBP通過減少脂質(zhì)積累和抑制主動(dòng)脈斑塊形成來改善AS。

圖3

3、潛在的差異代謝物篩選和通路富集

為了研究SBP對動(dòng)脈粥樣硬化的代謝影響，對小鼠血清樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)測定和分析。PCA是一種降尺度數(shù)據(jù)分析方法，它將最初鑒定出的代謝物進(jìn)行線性重組，形成一個(gè)新的復(fù)合變量。在對照組、AS組和SBP組中，組間分離明顯，組內(nèi)聚集嚴(yán)重（圖4A）。評價(jià)參數(shù)R2X、R2Y和Q2表明OPLS-DA具有良好的魯棒性，不會(huì)出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象（圖4B-C），因此適用于代謝物和通路分析。

圖4

為便于后續(xù)分析，兩個(gè)SBP劑量的數(shù)據(jù)合并為一組。對比對照組和AS組，得到了39個(gè)不同的代謝物。同樣，AS組和SBP組也得到了64個(gè)不同的代謝物。這兩種情況的交集產(chǎn)生了32個(gè)差異代謝物，它們是本研究的關(guān)鍵代謝物(圖5a-C）。此外，還發(fā)現(xiàn)了七條代謝途徑，包括亞油酸代謝、類固醇激素生物合成、肌醇磷酸代謝、鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、類固醇生物合成和初級膽汁酸生物合成（圖5D-F）。根據(jù)代謝組學(xué)分析，作者確定了可能影響動(dòng)脈粥樣硬化治療過程中代謝狀態(tài)的4種代謝物和SBP對經(jīng)TMAO處理的HUVEC的遷移、凋亡和氧化應(yīng)激的影響7條代謝途徑。

圖5

4、SBP對TMAO處理的HUVECs遷移、凋亡和氧化應(yīng)激的影響

對初始組和劃痕后24小時(shí)處理組的傷口面積進(jìn)行了量化和比較，結(jié)果表明TMAO抑制了細(xì)胞遷移，而相反地在SBP組中觀察到細(xì)胞遷移模式。這一發(fā)現(xiàn)表明，在刺激條件下，SBP與TMAO一樣能抵消對細(xì)胞遷移的抑制（圖6A-B）。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)。為了揭示TMAO和SBP對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，使用了流式細(xì)胞術(shù)。根據(jù)圖5C中紅色部分顯示，TMAO增加了早期和晚期凋亡細(xì)胞的比例。服用SBP后，凋亡細(xì)胞的比例下降，表明SBP抑制了TMAO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖6C-D）。此外，由于氧化應(yīng)激是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化惡化的重要因素，研究了SBP是否參與了細(xì)胞內(nèi)ROS的清除。TMAO明顯增加了HUVECs中的ROS水平，而SBP阻止了這些變化并降低了內(nèi)皮氧化應(yīng)激（圖6E-F）。這些結(jié)果表明，SBP可抑制TMAO誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，并減輕TMAO對細(xì)胞遷移的抑制作用。

圖6

5、SBP可減輕體內(nèi)和體外的內(nèi)皮功能障礙

內(nèi)皮功能障礙已被確定為誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的起始因素之一，而VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)對于內(nèi)皮功能障礙的調(diào)節(jié)至關(guān)重。研究SBP對內(nèi)皮損傷調(diào)控的體內(nèi)影響是通過免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的。在模型中，VCAM-1和ICAM-1的水平顯著升高。而SBP可抑制它們的表達(dá)（圖7A-D）。在體外，發(fā)現(xiàn)TMAO增加了HUVEC中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，相反，SBP組的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)明顯降低，這表明SBP在體外參與了對TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的保護(hù)。此外，LOX-1也是內(nèi)皮功能障礙的指標(biāo)之一，觀察了它在TMAO和SBP作用下是否與ICMA-1有相同的趨勢。TMAO可誘導(dǎo)HUVEC中LOX-1的表達(dá)上調(diào)，而SBP可抑制LOX-1的表達(dá)（圖7E-H）。因此，研究結(jié)果表明，SBP可降低主動(dòng)脈根部和HUVEC中LOX-1、ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，反映了SBP通過緩解內(nèi)皮功能障礙對AS具有保護(hù)作用。

圖7

6、通過減少M(fèi)APK3、AKT1和STAT3的表達(dá)，SBP可改善動(dòng)脈粥樣硬化的病情

通過結(jié)合初步的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)研究，作者預(yù)測MAPK3、AKT1和STAT3是SBP參與AS調(diào)控的關(guān)鍵靶標(biāo)；接下來試圖在體內(nèi)和體外驗(yàn)證這些結(jié)果，對MAPK3的免疫組化分析表明，模型組中MAPK3表達(dá)上調(diào)，而SBP中表達(dá)下調(diào)（圖8A-B）。對各組小鼠采集的主動(dòng)脈組織進(jìn)行的Western印跡分析表明，SBP逆轉(zhuǎn)了磷酸化(P)-MAPK3、P-AKT1和P-STAT3表達(dá)增加的趨勢（圖8C-F）。此外，體外實(shí)驗(yàn)表明，TMAO上調(diào)了HUVEC中P-MAPK3、P-AKT1和P-STAT3的表達(dá)，而SBP則降低了這些基因的表達(dá)（圖8G-J）。簡而言之，這些結(jié)果提供了SBP通過調(diào)節(jié)MAPK3、AKT1和STAT3緩解動(dòng)脈粥樣硬化的證據(jù)。

圖8

7、分子對接

為了研究SBP有效成分與核心靶點(diǎn)之間的相互作用，進(jìn)行了分子對接分析，選擇了山奈酚、N-核苷酸和麥角胺作為配體，并根據(jù)配體與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的程度選擇了山奈酚和麥角胺作為配體。選擇MAPK3、STAT3和AKT1作為受體，它們的the best結(jié)合模式和親和力如圖9所示。根據(jù)分子對接的結(jié)果，本研究中評估的三種SBP成分能夠與確定的三個(gè)靶點(diǎn)形成穩(wěn)定的相互作用。

圖9

8、酶抑制作用

為了驗(yàn)證分子對接的準(zhǔn)確性，通過酶抑制實(shí)驗(yàn)檢測了山奈酚、N-核苷酸和麥角胺對MAPK3、STAT3和AKT1的抑制作用。山奈酚、N-核苷酸和麥角胺對MAPK1的抑制率分別為（68.52±±0.40）%、（63.07±±0.45）%和（72.04±±0.07）%、圖10A）；對STAT3的抑制率分別為（59.84±±0.51)%、(60.84±±0.70)%和(61.84±±0.59)%（圖10B）。AKT1為(63.48±±0.45)%，(66.87±±0.47)%，(74.09±±0.45)%。0.49）%（圖10C）。以上結(jié)果均大于50%，其中麥角胺對AKT1的抑制作用最強(qiáng)，這與分子對接結(jié)果一致?？傊敢种茖?shí)驗(yàn)表明，這三種化合物對AKT1的抑制作用均在50%以上（圖10C）。對這三種蛋白質(zhì)的抑制作用，并在體外驗(yàn)證了分子對接的準(zhǔn)確性。

圖10

總結(jié)：本文的思路很完整，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)+代謝組學(xué)的綜合研究，并進(jìn)行了驗(yàn)證，為SBP通過介導(dǎo)腸道-心臟軸參與心血管保護(hù)提供了新的見解！傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！