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PCR實(shí)驗(yàn)介紹

實(shí)驗(yàn)步驟

1、 樣本總RNA提?。═rizol法）

1. 取適量待測(cè)樣本加入液氮后研磨粉碎；

2. 用1ml Trizol將研磨樣本轉(zhuǎn)移到取到1.5ml EP管中；

3. 向1.5ml EP管中加入500ul酚氯，仿振蕩混勻后，靜止5分鐘；

4. 4℃ 12000rpm離心10分鐘，小心吸取上清于一新的1.5ml EP管中；

5. 向分離出的上清中加入700ul異丙醇，充分混勻；

6. 4℃ 12000rpm離心10分鐘，小心棄上清；

7. 用75%乙醇洗滌沉淀一次，室溫晾干；

8. 50ul DEPC水溶解RNA沉淀；

9. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2、總RNA質(zhì)量檢測(cè)

使用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，測(cè)量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零，操作方法如下：

1.  抬起樣品臂，把樣品加到檢測(cè)基座上；

2.  放下樣本臂，使用電腦上的軟件開始吸光值檢測(cè)。在上下兩個(gè)光纖之間會(huì)自動(dòng)拉出一個(gè)樣品柱，然后進(jìn)行檢測(cè)；

3. 當(dāng)檢測(cè)完成后，抬起樣品臂，并用干凈的無塵紙把上下基座上的樣品擦拭干凈。

濃度測(cè)定

260nm處讀值為1表示40 ng RNA/μl。樣品RNA濃度計(jì)算公式為：A260 X 40 ng/μl。

純度檢測(cè)

RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測(cè)方法，比值范圍1.8到2.1。即使比值超出這個(gè)范圍，RNA樣品也一樣可以用于一些普通實(shí)驗(yàn)中如Northern雜交，RT-PCR和RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

3、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

逆轉(zhuǎn)錄使用invitrogen的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript III

1. 反應(yīng)體系1建立：

2. 混勻，離心。65℃，5分鐘，結(jié)束后置于冰上。

3. 反應(yīng)體系2建立：

4. 混勻，離心。置于42℃，水浴60分鐘。

5. 取出后置于85℃，反應(yīng)10分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

6. 反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物置于-20℃待用。

4、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

1. Real time PCR反應(yīng)體系建立：

2. 體系混勻后，瞬離一下，置于熒光定量PCR儀上，按照以下條件反應(yīng)：

3. Realtime PCR反應(yīng)條件

結(jié)果示例：

合作流程：

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