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一、概念：

      慢病毒是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120nm，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)、球形。病毒顆粒最外層是包膜(包膜蛋白決定了感染細胞的類型)，再往里依次為基質(zhì)蛋白和衣殼，最里面是兩條相同的正股RNA鏈和酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶)。

二、應(yīng)用：

1、慢病毒有廣泛的宿主范圍，能夠有效地感染分裂細胞、非分裂細胞，特別適合于一些難轉(zhuǎn)染的細胞（如原代細胞、干細胞、不分化的細胞）和對腺病毒感染具有較強免疫反應(yīng)的細胞（如樹突狀細胞、單核細胞和間充質(zhì)干細胞）等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加。

2、慢病毒能將外源基因有效地整合入宿主染色體上，介導(dǎo)目的基因穩(wěn)定、長期的表達。因此，可以利用慢病毒建立穩(wěn)定細胞株。

3、適用范圍更廣，不僅能用于體外實驗，還能用于活體動物模型，尤其是動物成瘤實驗。

三、實驗準備

1、狀態(tài)良好的HEK 293T細胞，一般使用復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細胞進行慢病毒的生產(chǎn)，要求無細菌、真菌以及支原體污染；

2、轉(zhuǎn)染試劑，如PEI、Higene、lipo2000或lipo3000

各種轉(zhuǎn)染試劑的步驟稍有差別，小助手以PEI為轉(zhuǎn)染試劑。

3、DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基、DMEM完全培養(yǎng)基（10%FBS和1%P/S）；

4、10mL無菌注射器(環(huán)氧乙烷滅菌處理)；

5、0.45μm的細菌濾器。

四、簡要包裝步驟

以六孔板中的1孔為例，每個樣品需要1x106個293T細胞

1、取1.5ml滅菌EP管，加入1.5ug包裝混合質(zhì)粒和0.5ug表達質(zhì)粒以及250ul的無血清培養(yǎng)基。輕柔混5.室溫孵育5min。

2、取1.5ml滅菌EP管，取9u脂質(zhì)體2000|溶于250ml無血清培養(yǎng)基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。3、將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min

4、用胰酶消化并記數(shù)293T細胞。用含血清的培養(yǎng)基重懸細胞。

5、在六孔板中每孔，加入1m含血清的生長培養(yǎng)基，再加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。

6、將1ml重懸的293T細胞(1x106個細胞/m)加入到平板中。37℃CCO2孵箱中孵育過夜7、移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除，代之以DMEM(含丙酮酸鈉和非必須氨基酸)7、轉(zhuǎn)染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉淀。

8、病毒上清-80°貯存。

包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率。

三、慢病毒滴度測定

病毒滴度的單位為：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的病毒顆粒的數(shù)目。

計算公式為：滴度=（感染時細胞數(shù)（個）*陽性細胞%）/病毒液體積（mL）

病毒液體積和感染時細胞數(shù)已知，需通過流式細胞術(shù)確認陽性細胞百分比。

滴度測定常常使用HEK 293T細胞，大致的原理為，將在DAY3收集到的病毒上清，按照梯度添加到293T細胞中，感染后48h檢測陽性細胞的比例，從而確定病毒的滴度。

五、注意事項

1、在慢病毒感染細胞前，為檢測病毒上清培養(yǎng)液內(nèi)病毒的活性，并確定病毒與轉(zhuǎn)染細胞之間的比率，需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過轉(zhuǎn)染Hela細胞，然后使用抗體篩選穩(wěn)定的細胞轉(zhuǎn)染株，進行計數(shù)和數(shù)值統(tǒng)計。

2、在慢病毒轉(zhuǎn)染細胞的過程中最重要的一步是融合，只有一些較小的慢病毒載體才能轉(zhuǎn)導(dǎo)進細胞，因此，病毒顆粒的吸附是慢病毒轉(zhuǎn)染的限速步驟。

3、293T細胞的代數(shù)最好用15代以內(nèi)，最多不超過20代，否則影響轉(zhuǎn)染效率。質(zhì)粒濃度在400-1000ng/μL范圍，純度260/280在1.8-2.0之間的轉(zhuǎn)染效率較高?；旌象w輕輕滴入細胞上清后搖勻，動作要輕，293T細胞貼壁不牢避免細胞脫落。