題目：單細(xì)胞分析揭示了乳腺癌亞型形成過(guò)程中的模擬進(jìn)化

英文名：Single-cell analyses reveal evolution mimicry during the specification of breast cancer subtype

雜志：Theranostics

影響因子：12.4

發(fā)表時(shí)間：2024年05月19日

研究背景：干細(xì)胞或祖細(xì)胞的前身通過(guò)遺傳和表觀遺傳程序賦予癌細(xì)胞發(fā)育的可塑性和獨(dú)特的細(xì)胞特性。目前還沒(méi)有利用新技術(shù)對(duì)乳腺癌的起源細(xì)胞進(jìn)行全面鑒定和繪圖，以揭示新的亞型特異性治療靶點(diǎn)。

研究思路：通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)整合了來(lái)自正常乳腺組織的195,144個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞和來(lái)自原發(fā)性乳腺癌樣本的406,501個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞，創(chuàng)建了人類正常乳腺和癌癥乳腺的大規(guī)模單細(xì)胞圖譜。通過(guò)將癌細(xì)胞與參考正常上皮細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，探索了惡性細(xì)胞的潛在異質(zhì)性來(lái)源。通過(guò)多組學(xué)分析以及體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，篩選并驗(yàn)證了潛在的亞型特異性治療靶點(diǎn)。在的隊(duì)列中，通過(guò)免疫組化驗(yàn)證了已確定的免疫和基質(zhì)細(xì)胞亞群的新型生物標(biāo)記物?；诎┘?xì)胞起源模式的腫瘤分層與臨床結(jié)果、基因組畸變和不同的微環(huán)境構(gòu)成相關(guān)。發(fā)現(xiàn)管腔祖細(xì)胞（LP）亞型與預(yù)后不良、基因組不穩(wěn)定和免疫微環(huán)境失調(diào)密切相關(guān)。然而，LP亞型患者對(duì)新輔助化療（NAC）、PARP抑制劑（PARPi）和免疫療法敏感。通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了LP亞型特異性靶點(diǎn)PLK1。此外，乳腺癌的大規(guī)模單細(xì)胞圖譜分析啟發(fā)識(shí)別了一系列與臨床相關(guān)的免疫和基質(zhì)細(xì)胞亞群，包括先天性淋巴細(xì)胞（ILCs）、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞亞群。

研究結(jié)果：

1、人類正常乳房和癌變?nèi)榉康拇笠?guī)模綜合細(xì)胞圖譜

為了生成全面的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄信息，從公開數(shù)據(jù)集（圖1A）中收集并分析了35個(gè)正常乳腺組織和181個(gè)原發(fā)性乳腺癌樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)，并繪制了正常乳腺組織和癌變?nèi)橄俳M織的轉(zhuǎn)錄圖譜。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)預(yù)處理后，共有195,144個(gè)來(lái)自正常乳腺組織的高質(zhì)量細(xì)胞和406,501個(gè)來(lái)自原發(fā)性乳腺癌樣本的高質(zhì)量細(xì)胞被納入的分析（圖1A）。為了確定正常乳腺組織細(xì)胞成分的特征，在校正了不同數(shù)據(jù)集的批次效應(yīng)后，對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行了基于圖的無(wú)監(jiān)督聚類（圖1B）。所有主要細(xì)胞類型，包括三個(gè)上皮亞群（BM、LP和ML）、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞，都根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行了注釋，并通過(guò)UMAP進(jìn)行了可視化（圖1B-C）。在腫瘤區(qū)室中，除了上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞外，還發(fā)現(xiàn)了豐富的免疫亞群，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞和髓系細(xì)胞，它們具有獨(dú)特的細(xì)胞特征（圖1D-E）。

圖1

2、乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞亞型的配準(zhǔn)

上述分析表明，正常乳房有三個(gè)上皮細(xì)胞大群，即BM、LP和ML亞群，并根據(jù)不同基因特征的表達(dá)確定了七個(gè)次要亞群（圖2A）。根據(jù)癌細(xì)胞起源模式和內(nèi)部異質(zhì)性，整個(gè)腫瘤細(xì)胞被分為20個(gè)亞群，并通過(guò)UMAP進(jìn)行可視化（圖2C）。利用ROGUE分析觀察到LP組的癌細(xì)胞在三大亞組中表現(xiàn)出highest的異質(zhì)性（圖2D）。為了了解這些腫瘤細(xì)胞群的基因組變化，使用inferCNV算法估算了單細(xì)胞拷貝數(shù)變異（CNVs），結(jié)果顯示LP組的惡性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的高CNV水平（圖2E）。此外，為了確定這些亞群的生物學(xué)特性，按照之前的描述確定了癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)狀態(tài)（圖2F）。此外，還利用標(biāo)志基因組研究了這些亞群的功能異質(zhì)性。雌激素反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)在ML亞型中富集（圖2G）。總之，根據(jù)癌細(xì)胞起源模式確定了乳腺癌細(xì)胞的三種分子亞型，并對(duì)每種分子亞型中的癌細(xì)胞狀態(tài)和功能異質(zhì)性進(jìn)行了細(xì)致的表征。

圖2

3、LP亞型乳腺癌的分子和臨床特征

為了確定已確定的癌細(xì)胞起源模式的臨床相關(guān)性，首先在METABRIC隊(duì)列中進(jìn)行了去卷積分析，去卷積樣本呈現(xiàn)出顯著的瘤內(nèi)異質(zhì)性（圖3A）。LP亞型與不良預(yù)后明顯相關(guān)，且與年齡、腫瘤分級(jí)、腫瘤大小、腫瘤分期、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和細(xì)胞周期評(píng)分無(wú)關(guān)（圖3B）。鑒于LP衍生癌細(xì)胞的CNV負(fù)擔(dān)較高，進(jìn)一步探討了TCGA數(shù)據(jù)集中LP為主的惡性腫瘤與基因組改變特征之間的關(guān)系。與單細(xì)胞分析推斷出的CNV負(fù)擔(dān)增加相一致，LP亞型的腫瘤顯示出較高的TMB水平，尤其是以下腫瘤COSMIC突變特征SBS3（與同源重組缺陷（HRD）有關(guān)）和SBS13，而非SBS2（均與APOBEC基因突變有關(guān)）介導(dǎo)的脫氨（圖3C）與HRD相關(guān)的復(fù)雜基因組改變事件（HRD評(píng)分）在LP評(píng)分較高（LP-高）的乳腺腫瘤中也顯著升高（圖3D）。值得注意的是，LP高患者對(duì)NAC和PARPi治療敏感（圖3E-F）。綜上所述，這些研究結(jié)果表明，LP亞型乳腺癌具有較高的TMB和基因組不穩(wěn)定性，但對(duì)NAC和PARPi治療敏感。接下來(lái)探討了臨床隊(duì)列中LP亞型乳腺癌的功能和免疫特征。基因組富集分析（GSEA）顯示，LP亞型的轉(zhuǎn)錄特征富集于γ干擾素反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和先天性免疫系統(tǒng)通路（圖3G）。然而，LP高的腫瘤表現(xiàn)出T細(xì)胞衰竭特征評(píng)分和各種免疫抑制檢查點(diǎn)表達(dá)水平的升高（圖3H）。此外，還發(fā)現(xiàn)，在I-SPY2隊(duì)列中，LP亞型患者更有可能在ICB聯(lián)合NAC治療后獲得pCR（圖3I）。為了確定PSAT1狀態(tài)與臨床進(jìn)展之間是否存在關(guān)系，對(duì)乳腺癌組織芯片進(jìn)行了IHC染色。結(jié)果顯示，PSAT1染色主要呈細(xì)胞質(zhì)狀（圖3J），PSAT1過(guò)表達(dá)表明無(wú)病生存期（DFS）較差。利用這些生物標(biāo)記物，的IHC隊(duì)列將LP分子亞型定義為PSAT1高/ER低/CK14低（圖3J），LP組顯示預(yù)后較差（圖3K）。綜上所述，發(fā)現(xiàn)了LP亞型乳腺癌具有明顯的低預(yù)后、特殊的分子和臨床特征，并進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證了候選標(biāo)志物，為臨床實(shí)踐提供了依據(jù)。

圖3

4、確定LP亞型乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)

考慮到染色體畸變是乳腺癌LP亞型的顯著特征，接下來(lái)致力于探索染色體不穩(wěn)定性的主要相關(guān)因素，并將其作為L(zhǎng)P亞型的潛在治療靶點(diǎn)，這涉及到不同的全局組學(xué)領(lǐng)域。結(jié)合本研究中通過(guò)整合單細(xì)胞和大容量RNA-seq分析得出的假定參與者，以及最近通過(guò)基因組規(guī)模的Perturb-seq調(diào)查發(fā)現(xiàn)的基因，成功地闡明了包括PLK1、TPX2、CDK1和AURKA在內(nèi)的260個(gè)候選基因群（圖4A-B）。此外，還利用GSVA技術(shù)計(jì)算了一系列乳腺癌細(xì)胞系的LP特征得分。精心鑒定出SUM-149PT是典型的LP亞型乳腺癌細(xì)胞系，而MCF-7。則是典型的非LP乳腺癌對(duì)照細(xì)胞系（圖4C）。為了篩選出參與LP亞型乳腺癌染色體不穩(wěn)定的主要因素，初步發(fā)現(xiàn)，抑制PLK1、TPX2、CDK1和AURKA對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了不同的影響，這一點(diǎn)可以從所觀察到的漸變中看出（圖4D）。選擇PLK1作為闡明LP亞型復(fù)雜性的關(guān)鍵因素。觀察到，抑制PLK1大大增強(qiáng)了SUM-149PT細(xì)胞的凋亡過(guò)程，而對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡沒(méi)有明顯影響（圖4E）。細(xì)胞遺傳學(xué)調(diào)查顯示，SUM-149PT細(xì)胞在經(jīng)歷PLK1損傷后，染色體畸變的頻率增加，包括染色體截?cái)嗪蛿嗔训痊F(xiàn)象（圖4F）。而在受到類似PLK1抑制的MCF-7細(xì)胞中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象（圖4F）。此外，還在小鼠模型中評(píng)估了PLK1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。值得注意的是，與對(duì)照載體細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)抑制了PLK1的SUM-149PT細(xì)胞的腫瘤擴(kuò)張速度減慢了（圖4G-I）。值得注意的是，在volasertib處理下，SUM-149PT細(xì)胞（而非MCF-7細(xì)胞）的細(xì)胞增殖受到明顯抑制，同時(shí)凋亡誘導(dǎo)也顯著增強(qiáng)（圖4J-K）。在SUM-149PT小鼠模型中，觀察到服用volasertib后腫瘤生長(zhǎng)也有類似的減弱（圖4L-N）。綜上所述，這些結(jié)果表明PLK1有可能是LP亞型乳腺癌中染色體不穩(wěn)定性的一個(gè)基本因素，因此成為L(zhǎng)P亞型乳腺癌領(lǐng)域中一個(gè)值得探索的治療靶點(diǎn)。

圖4

5、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)和先天淋巴細(xì)胞(ILC)的綜合分析

鑒于不同分子亞型乳腺癌的免疫微環(huán)境各不相同，接下來(lái)的目標(biāo)是通過(guò)整合scRNA-seq技術(shù)和生物信息學(xué)方法，構(gòu)建高分辨率的乳腺癌免疫細(xì)胞圖譜。首先，整合了156289個(gè)T細(xì)胞和NK/ILCs，確定了24個(gè)集群，其中包括7個(gè)CD4+T集群、8個(gè)CD8+T集群、6個(gè)循環(huán)T集群和3個(gè)NK/ILCs集群（圖5a）。然后，根據(jù)標(biāo)記基因的表達(dá)和功能特征對(duì)這些集群進(jìn)行了注釋（圖5B）。所有主要細(xì)胞類型都有代表，并且在不同的分子亞型中表現(xiàn)出不同的比例（圖5C）。為了探索這些集群的生物學(xué)特征，對(duì)不同亞群的幼稚型、細(xì)胞毒性型、衰竭型和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞特征進(jìn)行了初步評(píng)分（圖5D）。為了深入了解NK/ILC的組成，重建了NK/ILC的聚類，并確定了三個(gè)主要亞群，包括兩個(gè)NK細(xì)胞群和一個(gè)新的ILC3細(xì)胞群（圖5E）。FGFBP2+NK細(xì)胞顯著表達(dá)細(xì)胞毒性和效應(yīng)標(biāo)志物，如FGFBP2、FCGR3A和PRF1，并顯示出細(xì)胞溶解和吞噬途徑的富集（圖5F-G）。最后，研究了這種新型IL7R+ILC3集群的預(yù)后價(jià)值，發(fā)現(xiàn)IL7R+ILC3集群的高組成與較長(zhǎng)的無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）密切相關(guān)（圖5H），這表明這種新型ILC3集群可作為乳腺癌的一種可靠的預(yù)后生物標(biāo)志物。

圖5

6、乳腺癌中的髓樣細(xì)胞異質(zhì)性

為了進(jìn)一步確定乳腺腫瘤微環(huán)境（TME）中髓樣細(xì)胞的異質(zhì)性，分析了52,955個(gè)髓樣細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)，并基于無(wú)監(jiān)督圖譜將其聚類為19個(gè)基于典型細(xì)胞標(biāo)記的次要亞群（圖6A-B）。主要細(xì)胞系包括肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和循環(huán)髓系細(xì)胞（圖6A）。肥大細(xì)胞的特點(diǎn)是特異性高表達(dá)TPSAB1、TPSB2和KIT，在ML亞型樣本中含量豐富（圖6B-C）。根據(jù)經(jīng)典細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，DCs被分為多種亞型，包括傳統(tǒng)的1型和2型DCs（cDC1s、cDC2s）、遷移性DCs（mDCs）、類漿。細(xì)胞DCs（pDCs）和非典型DCs（nc-DCs）（圖6AB和圖S9A-B）。CD1A+cDC2集群rare地存在于ML亞型樣本中，并特異性表達(dá)朗格漢斯細(xì)胞標(biāo)志物，如CD1A和CD207（朗格林），這表明該集群代表朗格林+DCs（圖6C）。隨后，巨噬細(xì)胞形成了七個(gè)亞群，它們具有不同程度的"經(jīng)典活化"M1樣和"替代活化"M2樣巨噬細(xì)胞特征得分（圖6D）。據(jù)報(bào)道，在這些巨噬細(xì)胞亞群中，SPP1+TAM和C1QC+TAM這兩個(gè)TAM亞群表現(xiàn)出TAM的二分功能表型（圖6D）。此外，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)C1QC+CLEC10A+TAM亞群，它可能是類DCTAMs，具有HLA基因（HLADQA2和HLA-DQB1）、CLEC10A和CD1E的過(guò)表達(dá)。以及比經(jīng)典DC更高的TAM特征得分（圖6B、D）。值得注意的是，ML亞型樣本中富集的新型巨噬細(xì)胞亞群的特點(diǎn)是肌酸激酶腦同工酶（CKB）表達(dá)升高（圖6C-E）。CKB是肌酸激酶家族的成員，可在ATP和肌酸之間可逆地轉(zhuǎn)移高能磷酸基團(tuán)，生成磷酸肌酸和ADP。使用GSVA進(jìn)行的通路富集分析表明，氧化磷酸化和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體相互作用在CKB+巨噬細(xì)胞亞群中富集（圖6F）。

在METABRIC隊(duì)列中，較高的CKB+巨噬細(xì)胞組成和較高的CKB表達(dá)均與生存劣勢(shì)有關(guān)，IHC結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了CKB+細(xì)胞的增加表明DFS較差（圖6G-H）。在接受ICB治療的患者中，CKB+巨噬細(xì)胞的組成與免疫治療耐藥性和不良預(yù)后呈正相關(guān)（圖6I）?？傊?，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明了乳腺癌中腫瘤浸潤(rùn)髓系細(xì)胞的情況，并表明所發(fā)現(xiàn)的新型CKB+巨噬細(xì)胞亞群可能對(duì)預(yù)測(cè)乳腺癌的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)具有重要價(jià)值。

圖6

7、正常乳房和癌變?nèi)榉康幕|(zhì)區(qū)由不同類型的細(xì)胞組成

為了研究包括EC、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞（也稱為類血管周細(xì)胞（PVL））在內(nèi)的基質(zhì)區(qū)的異質(zhì)性，整合了正常乳房和癌癥乳房的基質(zhì)細(xì)胞，并校正了批次效應(yīng)。首先，分析了33,529個(gè)（18,096個(gè)來(lái)自乳腺癌，15,433個(gè)來(lái)自正常乳房）內(nèi)皮細(xì)胞，并鑒定了不同血管床（動(dòng)脈、毛細(xì)血管和靜脈）的不同淋巴管和血管（圖7A）。根據(jù)保守標(biāo)記注釋了正常乳房和癌變?nèi)榉恐械乃膫€(gè)主要內(nèi)皮分區(qū)（圖7B）。令人驚訝的是，正常乳房和癌變?nèi)榉康膬?nèi)皮細(xì)胞未能均勻地混合在一起，顯示出它們之間明顯的生物學(xué)差異。在正常乳腺和癌變?nèi)橄俚耐磧?nèi)皮細(xì)胞中觀察到了一系列不同表達(dá)的標(biāo)記物。例如，PDPN和CCL21在正常乳腺和惡性乳腺的淋巴細(xì)。胞中均有過(guò)表達(dá)（圖7B）。此外，AKR1C1只在正常乳腺組織的淋巴細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，而LYVE1則在惡性腫瘤的淋巴細(xì)胞中明顯表達(dá)（圖7B）。為了進(jìn)一步闡明乳腺癌中EC的異質(zhì)性，首先進(jìn)行了ROGUE分析。結(jié)果表明，在四個(gè)EC亞群中，毛細(xì)血管EC的異質(zhì)性highest，然后，毛細(xì)血管細(xì)胞被進(jìn)一步重新聚類為五個(gè)亞群（圖7C）。此外，CA4+毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯表達(dá)與脂肪酸和甘油的攝取和代謝有關(guān)的標(biāo)記物，包括FABP4、FABP5和CD36（圖7D）。還確定了一種血管生成基因（PGF）表達(dá)較高的血管生成毛細(xì)血管EC（圖7D）。觀察到這些毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞亞型的比例存在差異，在ML亞型樣本中發(fā)現(xiàn)CA4+毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的比例明顯下降（圖7E）。在METABRIC隊(duì)列中，CA4+毛細(xì)血管EC特征與優(yōu)越的存活率相關(guān)（圖7F）。此外，還進(jìn)行了IHC分析，以確定患者生存率與CA4+毛細(xì)血管EC豐度之間的關(guān)系。在的隊(duì)列中觀察到類似的結(jié)果（圖7G-H）。相比之下，血管生成毛細(xì)血管細(xì)胞豐度較高的患者生存期明顯較短。此外，對(duì)血管生成抑制劑曲班尼（trebananib）敏感的患者表現(xiàn)出血管生成毛細(xì)血管細(xì)胞特征評(píng)分升高（圖7I）。此外，還發(fā)現(xiàn)，對(duì)ICB治療敏感的膀胱癌患者血管生成毛細(xì)血管EC的組成減少，且與不良預(yù)后相關(guān)（圖7J-K）?？傊@些分析建立了EC的細(xì)胞圖譜，可能有助于闡明乳腺癌中EC亞群的異質(zhì)性、功能和臨床意義。

圖7

總結(jié)：本文利用scRNA-seq和Bulk RNA-seq數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研究揭示了乳腺癌的細(xì)胞譜系和起源細(xì)胞模式。傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！