題目：代謝組學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示黃芪皂苷IV對(duì)酒精性肝病的保護(hù)作用

英文名：Metabolomics combined with network pharmacology reveals the protective effect of astragaloside IV on alcoholic liver disease

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7/Q1

發(fā)表時(shí)間：2024年9月

研究背景：酒精性肝?。ˋLD）是造成肝損傷的重要因素。然而，治療ALD的臨床方案卻很有限。黃芪皂苷IV（AST-IV）是從黃芪（AM）中分離出來的一種皂苷。本研究旨在通過整合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探索AST-IV在ALD中的潛在作用機(jī)制。

研究思路：用Sprague-Dawley(SD)大鼠建立ALD大鼠模型，開展實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)AST-IV對(duì)ALD的保肝作用。測(cè)量了大鼠的體重、肝臟指數(shù)、ALT、AST、TC、TG、炎癥指標(biāo)（IL-1β、IL-6和TNF-α）和氧化應(yīng)激標(biāo)記物（SOD、MDA），并使用H&E和ORO染色來評(píng)估AST-IV和MDA的保肝效果，初步了解AST-IV在ALD中的潛在作用。隨后，進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)研究，預(yù)測(cè)AST-IV對(duì)ALD大鼠脂質(zhì)代謝的影響。代謝組學(xué)可以全面地分析生物體內(nèi)代謝物的變化，從而揭示藥物對(duì)機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)作用。然后，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確定了AST-IV矯正脂質(zhì)代謝紊亂的核心靶點(diǎn)，并通過分子對(duì)接、qRT-PCR和Western Blot分析驗(yàn)證了這些靶點(diǎn)。最后，利用斯皮爾曼相關(guān)分析法計(jì)算了ALD相關(guān)生化指標(biāo)、不同肝臟代謝物和核心靶點(diǎn)之間的關(guān)系，結(jié)果表明AST-IV可改善肝癌大鼠肝細(xì)胞的病理損傷并減少脂質(zhì)積累，研究流程見圖1。

圖1

研究結(jié)果：

1、AST-IV可改善乙醇誘導(dǎo)的ALD大鼠肝損傷

在喂食乙醇的28天內(nèi)，大鼠體重顯著下降（圖2A），喂食乙醇導(dǎo)致肝指數(shù)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高，表明肝損傷嚴(yán)重，同時(shí)TG和TC水平升高，表明脂質(zhì)代謝紊亂（圖2B-F）。H&E和ORO染色法進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，由于乙醇喂養(yǎng)，肝細(xì)胞中出現(xiàn)了不規(guī)則的肝索、空泡化以及脂質(zhì)堆積現(xiàn)象（圖2G和H）。此外，大鼠肝臟細(xì)胞核Nrf2、CAT蛋白和血清。SOD水平降低，細(xì)胞質(zhì)Nrf2、Keap1、HO-1蛋白和血清MDA水平升高，表明乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用顯著（圖3A、B）。此外，炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平隨著ALD的進(jìn)展而升高（圖3C-E）。每天灌胃50、100或200毫克/千克AST-IV和10mg/kgPPC在肝臟組織學(xué)、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥方面顯示出對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝損傷的有效保護(hù)（圖2A-H、3A-E）。這些研究結(jié)果表明，AST-IV可改善乙醇誘導(dǎo)的大鼠肝損傷。

圖2

圖3

2、AST-IV可糾正ALD大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的問題

在肝臟中，OPLS-DA圖明確區(qū)分了對(duì)照組、EtOH組和EtOH+AST組（圖4A和B）。此外，PCA評(píng)分圖顯示，代謝物在對(duì)照組和乙醇組之間，以及乙醇組和乙醇+AST-IV組之間有明顯的差異（圖4C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，AST-IV可改善乙醇引起的肝臟代謝紊亂。使用OPLS-DA（VIP>1）和t檢驗(yàn)（P<0.05）確定差異代謝物。對(duì)照組和EtOH組之間共發(fā)現(xiàn)811個(gè)差異代謝物（圖4D），EtOH組和EtOH+AST-IV組之間共發(fā)現(xiàn)745個(gè)差異代謝物（圖4E），對(duì)照組與EtOH組、EtOH組與EtOH+AST-IV組之間共發(fā)現(xiàn)544個(gè)重疊差異代謝物（圖4F）。繪制了一張熱圖來顯示三組重疊差異代謝物的強(qiáng)度水平（圖5a）。圖5B顯示了重疊差異代謝物前15個(gè)通路的KEGG通路富集分析，突出顯示了涉及精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、壞死、核苷酸代謝、糖共磷脂酰肌醇（GPI）-錨生物合成、鞘脂代謝、甘油磷脂代謝以及?；撬岷偷团；撬岽x的通路。由于ALD以脂肪肝和肝細(xì)胞壞死為特征，脂質(zhì)代謝、壞死途徑和代謝物相應(yīng)變化之間的聯(lián)系見圖5C。

圖4

圖5

3、AST-IV通過作用于脂質(zhì)代謝途徑和靶點(diǎn)改善ALD

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從蛋白質(zhì)水平研究了AST-IV治療ALD的機(jī)制。AST-IV靶點(diǎn)從四個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得，確定了235個(gè)AST-IV靶標(biāo)。使用搜索詞"酒精性肝病"，檢索肝病靶標(biāo)通，發(fā)現(xiàn)了803個(gè)與ALD相關(guān)的基因。通過維恩圖分析，確定了63個(gè)AST-IV和ALD的共同靶標(biāo)（圖6A）。利用Cytoscape（圖6B）將AST-IV靶點(diǎn)和共同靶點(diǎn)可視化，隨后，針對(duì)這些共同靶點(diǎn)構(gòu)建了一個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，顯示了排名前十的靶點(diǎn)（圖6C）。應(yīng)用Cytoscape的七種算法、維恩對(duì)角線分析，最終確定了六個(gè)共同的中樞基因：CYP1A2、HMOX1、CYCS、HSP90AA1、MMP2和FGF2（圖6D）。構(gòu)建了一個(gè)由六個(gè)常見關(guān)鍵基因組成的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)（圖6E）。然后對(duì)共同靶標(biāo)進(jìn)行KEGG富集分析，以確定AST-IV治療ALD的潛在途徑（圖6F）。結(jié)果顯示，AST-IV可能通過亞油酸代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、過氧化物酶體和色氨酸代謝等途徑對(duì)ALD起作用。

圖6

4、AST-IV與核心蛋白的結(jié)合力很強(qiáng)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證AST-IV與ALD核心靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合能力，使用AutoDock進(jìn)行了分子對(duì)接。RIPK3、MLKL、CYP1A2、CYP2C19、PPARα和PCSK9作為對(duì)接受體，AST-IV作為對(duì)接配體。對(duì)接結(jié)果使用PyMOL軟件可視化（圖7A-F）。結(jié)合能用于評(píng)估小分子與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間相互作用的強(qiáng)度。結(jié)合能越低，表明復(fù)合物越穩(wěn)定，結(jié)合活性越高。結(jié)合能顯示，AST-IV與RIPK3、MLKL、CYP1A2、CYP2C19、PCSK9和PPARα有很強(qiáng)的結(jié)合力。

圖7

5、AST-IV可減輕乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死

乙醇引起的肝損傷通常以肝細(xì)胞壞死為特征。為了評(píng)估AST-IV對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死的保護(hù)作用，用電子顯微鏡觀察了不同組大鼠的肝細(xì)胞。電子顯微鏡圖顯示，AST-IV可減輕乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積和線粒體腫脹（圖8A）。此外，我們還評(píng)估了關(guān)鍵壞死相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，包括p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL和MLKL。Western印跡分析表明，乙醇組中p-MLKL和p-RIPK3的水平升高，而AST-IV可減少乙醇誘導(dǎo)的p-MLKL和p-RIPK3的表達(dá)（圖8B-D）?？傊@些結(jié)果表明AST-IV可改善乙醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累和肝細(xì)胞壞死。

圖8

6、核心目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與預(yù)測(cè)結(jié)果一致

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的結(jié)果，進(jìn)行了qRT-PCR和Western印跡來評(píng)估核心蛋白的表達(dá)。ALD大鼠體內(nèi)CYP1A2和CYP2C19的mRNA和蛋白水平顯著下降，而AST-IV能夠逆轉(zhuǎn)這一過程（圖9A，D-F）。此外，在EtOH組中，CYP1A2和CYP2C19的mRNA和蛋白質(zhì)水平均明顯下降（圖9A，D-F）。與對(duì)照組相比，脂質(zhì)代謝標(biāo)志物PCSK9的mRNA和蛋白水平升高，PPARа的mRNA和蛋白水平降低。相比之下，AST-IV治療可使這些mRNA和蛋白水平恢復(fù)到與對(duì)照組相似的水平（圖9B、C、G-I）。這些研究結(jié)果表明，AST-IV能糾正乙醇引起的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，表明AST-IV可通過靶向CYP1A2、CYP2C19、PSCK9和PPARα來緩解大鼠的ALD。

圖9

7、與ALD相關(guān)的血清生化指標(biāo)、核心靶標(biāo)和肝臟差異代謝物具有相關(guān)性

為了進(jìn)一步闡明AST-IV減輕ALD的機(jī)制，對(duì)ALD相關(guān)生化指標(biāo)、核心靶點(diǎn)和肝臟差異代謝物進(jìn)行了斯皮爾曼相關(guān)性分析（圖10A）。為了直觀地表示這些相關(guān)性，用關(guān)聯(lián)構(gòu)建了涉及ALD相關(guān)生化標(biāo)志物、核心靶標(biāo)和肝臟差異代謝物的網(wǎng)絡(luò)（圖10B）?？傊?，這些結(jié)果表明，AST-IV可通過抑制乙醇誘導(dǎo)的壞死和改善脂質(zhì)代謝來減輕ALD。

圖10

總結(jié)：本文思路清晰，采用生信分析+實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的研究方法，揭示了揭示黃芪皂苷IV對(duì)酒精性肝病的保護(hù)作用！傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！