題目：新型系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)流水線揭示了羅漢松樹(shù)脂素在前列腺癌中的抗轉(zhuǎn)移潛力：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的綜合方法

英文名：Novel systems biology experimental pipeline reveals matairesinol’s antimetastatic potential in prostate cancer: an integrated approach of network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation

雜志：Briefings in Bioinformatics

影響因子：Q1/6.8

發(fā)表時(shí)間：2024年9月5號(hào)

研究背景：羅漢松樹(shù)脂素（MAT）是一種植物木質(zhì)素，因其在乳腺癌和前列腺癌等激素敏感性癌癥中的抗癌特性而聞名，在治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌（mPC）方面提供了一條有前景但未被充分開(kāi)發(fā)的途徑。

研究思路：為了闡明其特定的治療靶點(diǎn)和機(jī)制，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（NP）、生物信息學(xué)、基于基因MANIA的功能關(guān)聯(lián)（GMFA）和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證融為一體研究方法。通過(guò)挖掘在線數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了27個(gè)mPC和MAT的共同靶點(diǎn)，通過(guò)STRING構(gòu)建了MAT-mPC蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并利用CytoHuba確定了11個(gè)中心靶點(diǎn)，如EGFR、AKT1、ERBB2、MET、IGF1、CASP3、HSP90AA1、HIF1A、MMP2、HGF和MMP9。利用DAVID，GO分析強(qiáng)調(diào)了轉(zhuǎn)移相關(guān)過(guò)程，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞遷移的正調(diào)控，以及關(guān)鍵的KEGG通路分析，包括癌癥、前列腺癌、PI3K-Akt和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而UALCAN和GEPIA2等數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了前11個(gè)中心靶點(diǎn)在mPC患者生存分析和基因表達(dá)模式中的臨床意義。運(yùn)用一種新的富集方法（GMFA）進(jìn)一步豐富了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果。分子對(duì)接分析表明了MAT與11個(gè)中心靶點(diǎn)之間的實(shí)質(zhì)性相互作用。模擬研究證實(shí)了MAT與選定靶點(diǎn)的穩(wěn)定相互作用。利用RT-qPCR和各種基于細(xì)胞的檢測(cè)方法在PC3細(xì)胞中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證實(shí)了MAT對(duì)mPC的抗轉(zhuǎn)移作用。總的來(lái)說(shuō)，進(jìn)行了詳盡的NP分析，輔以GMFA、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，強(qiáng)調(diào)了MAT在通過(guò)不同治療途徑靶向mPC方面的多方面作用。

研究結(jié)果：

1、構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并分析MAT針對(duì)mPC的前11個(gè)樞紐目標(biāo)

采用了一種系統(tǒng)方法來(lái)預(yù)測(cè)針對(duì)mPC的MAT靶點(diǎn)。首先，從Swiss Target Prediction、Pharmapper和Superpred數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索了MAT靶點(diǎn)，得出了524個(gè)潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，還從GeneCards和DisGeNet數(shù)據(jù)庫(kù)中確定了mPC靶點(diǎn)，得出了236個(gè)靶點(diǎn)。交叉分析發(fā)現(xiàn)了MAT針對(duì)mPC的27個(gè)潛在治療靶點(diǎn)（PTM-mPC）（圖1A）。PPI網(wǎng)絡(luò)包括27個(gè)從mPC和MAT基因交叉點(diǎn)識(shí)別出的PTM-mPC中心靶標(biāo)（圖1B）。該網(wǎng)絡(luò)有27個(gè)節(jié)點(diǎn)，163條邊，平均PPI富集P值小于1.0e-16，平均局部聚類(lèi)系數(shù)為0.75，平均節(jié)點(diǎn)度為12.1。通過(guò)CytoHubba插件，Cytoscape分析進(jìn)一步確定了前11個(gè)基因--EGFR、AKT1、ERBB2、MET、IGF1、CASP3、HSP90AA1、HIF1A、MMP2、HGF和MMP9（圖1C），這些基因按其程度算法得分排序，用顏色表示節(jié)點(diǎn)程度。

圖1

2、通路的富集分析和MAT靶向mPC的預(yù)測(cè)靶標(biāo)的C-T-P網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用DAVID分析了KEGG通路中的27條共同路徑，以了解MAT誘導(dǎo)的mPC進(jìn)展改變。發(fā)現(xiàn)了36條通路（FDR≤0.05，P值≤0.05），前20條通路見(jiàn)圖2A。構(gòu)建了一個(gè)“化合物-靶點(diǎn)-通路（C-T-P）”網(wǎng)絡(luò)（圖2B），以直觀顯示MAT、其目標(biāo)和相關(guān)通路。值得注意的通路包括：癌癥中的通路、癌癥中的原茶聚糖、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、前列腺癌和表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑抗性。前列腺癌與8個(gè)基因密切相關(guān)，包括GSK3B、HSP90AA1、ERBB2、AKT1、IGF1、MMP9、表皮生長(zhǎng)因子受體、和表皮生長(zhǎng)因子受體2在C-T-P網(wǎng)絡(luò)中的作用，突顯了MAT與癌癥相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)之間的潛在聯(lián)系。利用DAVID進(jìn)行的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，150個(gè)BP、20個(gè)CC和35個(gè)MF術(shù)語(yǔ)的P值達(dá)到了≤0.05閾值。應(yīng)用FDR過(guò)濾器（FDR≤0.05）得到34個(gè)BP項(xiàng)、3個(gè)CC項(xiàng)和16個(gè)MF項(xiàng)。圖2C顯示了前15個(gè)BP和MF術(shù)語(yǔ)以及3個(gè)CC術(shù)語(yǔ)。BP富集包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等通路。CC術(shù)語(yǔ)表明基因存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞外空間等細(xì)胞區(qū)域。MF分析顯示了一些關(guān)鍵功能，如如蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合和激酶活性。這項(xiàng)分析加深了人們對(duì)MAT對(duì)mPC治療作用的了解。

圖2

3、基因表達(dá)模式比較分析，重點(diǎn)關(guān)注MAT在正常組織和腫瘤組織中針對(duì)mPC的前11個(gè)樞紐靶點(diǎn)

利用UALCAN等公開(kāi)數(shù)據(jù)集對(duì)前列腺腺癌患者的前11個(gè)樞紐靶點(diǎn)進(jìn)行了基因表達(dá)分析。與正常組織相比，MMP-9、AKT1和CASP3在原發(fā)性腫瘤、高Gleason評(píng)分（6-10分）和轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)中的表達(dá)明顯增加。此外，隨著格里森評(píng)分的升高，AKT1、ERBB2、HSP90AA1和MMP9的表達(dá)也呈上升趨勢(shì)，盡管AKT1和ERBB2在格里森評(píng)分為10時(shí)的表達(dá)有所下降（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了樞紐靶點(diǎn)在不同前列腺腺癌進(jìn)展階段的不同表達(dá)模式。

圖3

4、前列腺腺癌前11個(gè)樞紐基因的存活率分析：對(duì)患者預(yù)后和治療策略的影響

生存圖分析評(píng)估基因表達(dá)模式和患者生存結(jié)果，這對(duì)預(yù)后和治療策略至關(guān)重要。利用GEPIA2分析了前11個(gè)樞紐靶點(diǎn)的OS和無(wú)復(fù)發(fā)生存（RFS）概率（圖4）。生成中位數(shù)截?cái)嘀禐?0%且風(fēng)險(xiǎn)比為95%置信區(qū)間的圖。值得注意的是，在RFS分析中，HSP90AA1、MMP2、AKT1、CASP3和ERBB2的生存率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。相反，隨著前列腺癌的進(jìn)展，HIF1A、HSP90AA1、AKT1、MMP9和ERBB2表達(dá)的升高會(huì)顯著降低總生存率。這些研究結(jié)果表明，中樞基因表達(dá)水平對(duì)前列腺癌患者的生存結(jié)果有重大影響。

圖4

5、MAT針對(duì)mPC的前11個(gè)樞紐靶標(biāo)的分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬研究

通過(guò)分子對(duì)接，探索了MAT與前11個(gè)mPC靶點(diǎn)的相互作用，以了解它們的結(jié)合親和力和治療意義。觀察到MAT與ERBB2（-8.6）、AKT1（-8.5）、MMP-9（-8.4）、MET（-7.8）和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）（-7.6）的結(jié)合能值較低，表明其具有較強(qiáng)的親和力。值得注意的是，MAT與酪氨酸激酶膜受體ERBB2、表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和MET有很高的親和力，這表明它可能會(huì)抑制酪氨酸激酶的活性。此外，MAT與HSP90AA1和MMP-2的結(jié)合能分別為-7.1和-5.5 kcal/mol（圖5）。由于沒(méi)有合適的PDBID用于抑制位點(diǎn)的共晶體結(jié)合，作者進(jìn)行了與IGF1R和MET（IGF1和HGF生長(zhǎng)因子的受體）的對(duì)接分析。此外，還進(jìn)行了MAT與CASP3的抑制劑XIAP的對(duì)接，以研究MAT對(duì)CASP3激活的可能調(diào)節(jié)作用，考慮到缺乏支持CASP3激活位點(diǎn)的合適PDBID，對(duì)接結(jié)合能（-6.1）。

圖5

根據(jù)它們?cè)?mPC 中的結(jié)合親和力和生物學(xué)相關(guān)性，前5個(gè)樞紐靶標(biāo)ERBB2、AKT1、MMP9、MET和EGFR進(jìn)行MD模擬（圖6）。RMSD分析表明，與ERBB2-CL復(fù)合物（平均RMSD：0.5nm）相比，ERBB2-MAT復(fù)合物（平均RMSD：0.3nm）具有更好的穩(wěn)定性。RMSF分析表明，MAT結(jié)合的ERBB2波動(dòng)較小。ERBB2-MAT復(fù)合物的Rg保持穩(wěn)定~2nm。AKT1-MAT。在50ns之前，RMSD比較穩(wěn)定，但之后就出現(xiàn)了偏差。RMSF在AKT1-MAT的N端結(jié)構(gòu)域波動(dòng)較大。AKT1-MAT的Rg穩(wěn)定在2.2nm。MMP9復(fù)合物顯示出相似的RMSDRMSF，Rg穩(wěn)定在1.525nm。與MET-CL相比，MET-MAT的RMSD稍低，RMSF和穩(wěn)定Rg相似。表皮生長(zhǎng)因子受體復(fù)合物的RMSD和RMSF較高，穩(wěn)定的Rg~2.2nm。CL與表皮生長(zhǎng)因子受體形成了三個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，而MAT則偶爾形成氫鍵。

圖6

6、基于GeneMANIA的MAT針對(duì)mPC的前11個(gè)樞紐靶標(biāo)的功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

作者利用他們之前建立的GeneMANIA分析方法，擴(kuò)展了前11個(gè)中心目標(biāo)基因列表，確定了每個(gè)中心靶點(diǎn)增加10個(gè)基因（圖7），從而形成GMFA擴(kuò)展數(shù)據(jù)（GMFA-ED）。去除重復(fù)基因后，該數(shù)據(jù)集由112個(gè)基因組成，有助于進(jìn)行全面的基因-基因相互作用分析。GMFA方法整合了共表達(dá)、遺傳相互作用和物理相互作用參數(shù)，以捕捉與疾病過(guò)程相關(guān)的各種基因。GMFA-ED在隨后的GO和KEGG富集分析中發(fā)揮了重要作用，為探索與已識(shí)別基因相關(guān)的功能意義奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖7

7、GO和KEGG富集分析、C-T-P網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及與MAT和mPC相關(guān)的GMFA-ED富集比較分析

GMFA-ED數(shù)據(jù)集揭示了一個(gè)擴(kuò)展的基因網(wǎng)絡(luò)，其中包括112個(gè)基因，形成了一個(gè)功能基因網(wǎng)絡(luò)（FGN）（圖8A）。使用DAVID對(duì)基因本體論和通路進(jìn)行了分析。數(shù)據(jù)庫(kù)揭示了BP的顯著富集，包括對(duì)mPC進(jìn)展至關(guān)重要的通路，如蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)調(diào)控以及細(xì)胞遷移。此外，與質(zhì)膜相關(guān)的富集CC基底外側(cè)質(zhì)膜和基底質(zhì)膜等蛋白，強(qiáng)調(diào)了它們?cè)诎┌Y轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性。經(jīng)GMFA-ED分析后富集的中頻蛋白表明，它們與生長(zhǎng)因子受體相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，包括蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸、生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合（圖8B）?；蚪M學(xué)分析后的KEGG通路分析顯示了mPC相關(guān)信號(hào)的豐富性，突出了癌癥中的HIF1A、ErbB、FOXO和微陣列等通路。PI3K/Akt信號(hào)顯示了廣泛的富集，強(qiáng)調(diào)了關(guān)鍵的參與者與GMFA-ED分析前相比AT-Targets-Pathways網(wǎng)絡(luò)顯示了顯著的相互作用（圖8C）。利用來(lái)自GMFA-ED的前20個(gè)信號(hào)通路構(gòu)建的MAT-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)揭示了顯著的相互作用（圖8C）。該網(wǎng)絡(luò)有82個(gè)節(jié)點(diǎn)（MAT、61個(gè)靶標(biāo)和20個(gè)通路）和392條邊、表明MAT通過(guò)關(guān)鍵信號(hào)通路中的各種靶點(diǎn)明顯參與（圖8D），包括癌癥中的通路、PI3K/Akt通路、癌癥中的蛋白聚糖、MAPK信號(hào)通路，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了這些通路在介導(dǎo)MAT對(duì)mPC的抗轉(zhuǎn)移治療效果方面的共同作用。

圖8

圖9展示了GMFA實(shí)施前后GO和KEGG富集分析的直觀對(duì)比（PTM-mPC與GMFA-ED）。GMFA-ED的GO和KEGG富集分析揭示了與MAT對(duì)抗mPC的潛在靶點(diǎn)相關(guān)的BP、CC和MF的全面富集情況。與最初的樞紐靶標(biāo)（PTM-mPC）富集相比，這些富集更為相關(guān)，有助于深入了解MAT在mPC中潛在抗轉(zhuǎn)移作用的復(fù)雜分子機(jī)制。在前列腺癌方面，GMFA-ED富集后的KEGG通路分析確定了PI3K-Akt信號(hào)通路中基因的大量富集。值得注意的是，這種富集包括六個(gè)基因：GF、GFR、PI3K、Grb2、PTEN和Akt。需要強(qiáng)調(diào)的是在對(duì)PTM-mPC的初步分析中，除了GF、GFR和Akt外，沒(méi)有觀察到MAT的富集作用，而GF、GFR和Akt先前已被確定為MAT的靶點(diǎn)。這強(qiáng)調(diào)了通過(guò)GMFA-ED分析在揭示PI3K-Akt信號(hào)通路參與MAT對(duì)前列腺癌的潛在抗轉(zhuǎn)移作用方面所獲得的更強(qiáng)、更具體的見(jiàn)解（圖10）。

圖9

圖10

8、MAT預(yù)測(cè)的PI3K/AKT信號(hào)通路靶標(biāo)的分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬研究

作者選擇了在mPC中起關(guān)鍵作用的PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵成分進(jìn)行全面的分子對(duì)接和模擬研究。由IGF1、HGF和EGF等生長(zhǎng)因子引發(fā)的PI3K信號(hào)激活會(huì)導(dǎo)致AKT驅(qū)動(dòng)級(jí)聯(lián)的下游激活。MAT對(duì)PI3K/Akt通路中的成分具有顯著的親和力（圖11），顯示出較低的親和力。與IGF1R（-8.1 kcal/mol）、PI3KCA（-7.5 kcal/-mol）、PTEN（-7.1 kcal/mol）和AKT1的結(jié)合能。值得注意的是，PI3K/AKT信號(hào)通路中的其他靶點(diǎn)先前也進(jìn)行了分子對(duì)接和MD模擬研究，這是PTM-mPC確定的前10個(gè)中心靶點(diǎn)分析的一部分。對(duì)接研究中的前三個(gè)復(fù)合物進(jìn)行了MD模擬。PI3KCA主干原子的RMSD分析表明，與PI3KCA-CL復(fù)合物相比，PI3KCA-MAT復(fù)合物的平均RMSD略高于PI3KCA-CL（圖12）。RMSF分析表明，兩種復(fù)合物中環(huán)路區(qū)域（250-500）內(nèi)殘基的側(cè)鏈原子都有明顯波動(dòng)。MAT始終形成5個(gè)一致的氫鍵，而CL形成3個(gè)氫鍵，偶爾達(dá)到maximum值5個(gè)。就IGF1R復(fù)合物而言，IGF1R-MAT復(fù)合物的RMSD偏差很大，而IGF1RCL復(fù)合物的RMSD保持穩(wěn)定，但略微偏高。兩者的RMSF除了末端殘基和殘基~950-1000。兩種復(fù)合物的Rg最初都有偏差，穩(wěn)定在2.5nm左右。MAT形成了4個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，而CL在最初10毫微秒內(nèi)最多形成5個(gè)氫鍵，之后偶爾形成2個(gè)氫鍵。在PTEN復(fù)合物中，RMSD在50ns后趨于穩(wěn)定，平均為0.3nm，側(cè)鏈原子的波動(dòng)與apo和PTEN-MAT復(fù)合物相似。Rg在最初出現(xiàn)偏差后穩(wěn)定在2.25nm，MAT在整個(gè)過(guò)程中偶爾形成2個(gè)氫鍵。

圖11

圖12

9、MAT對(duì)PC3細(xì)胞具有抗癌活性，抑制了PC3細(xì)胞的克隆生成能力

MAT對(duì)PC3細(xì)胞的抗增殖作用是在24、48和72小時(shí)內(nèi)通過(guò)MTT試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估的（圖13A）。在特定時(shí)間間隔（24、48和72小時(shí)）內(nèi)，MAT處理后細(xì)胞存活率的降低呈劑量依賴(lài)性，這證實(shí)了MAT對(duì)轉(zhuǎn)移性PC3前列腺癌細(xì)胞的抗癌潛力。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，MAT抑制了PC3細(xì)胞的克隆生成能力，MAT的影響可直觀地顯示出來(lái)（圖13B），隨著MAT濃度的增加，細(xì)胞集落和細(xì)胞數(shù)量減少（圖13C）。定量分析顯示，克隆生成性的降低與劑量有關(guān)，MAT劑量為50μM（1.196倍）、100μM（1.44倍）和200μM（2.097倍）時(shí)，克隆生成性顯著降低（圖13D）。

圖13

10、MAT可抑制PC3前列腺癌細(xì)胞的遷移，減少基于肌動(dòng)蛋白的片層和絲狀細(xì)胞的形成

傷口愈合試驗(yàn)評(píng)估了PC3細(xì)胞的遷移，結(jié)果表明MAT處理對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用呈劑量依賴(lài)性（圖14A）。相比之下，50、100和200μM的MAT處理可抑制遷移，使開(kāi)放傷口面積百分比達(dá)到10.99%、經(jīng)ImageJ軟件分析量化，分別為24.48%和71.33%。位于細(xì)胞表面的富含肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)（即絲狀體和片狀體）通過(guò)促進(jìn)ECM重塑，在轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)著細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲，對(duì)癌癥的轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)起著重要作用。TRITC-鬼筆環(huán)肽染色實(shí)驗(yàn)表明，在MAT處理24小時(shí)后，絲狀突起和片狀突起的形成明顯減少，且呈劑量依賴(lài)性（圖14B）。

圖14

11、通過(guò)qPCR分析，MAT在mRNA水平下調(diào)了樞紐靶標(biāo)

MAT處理明顯改變了PC3細(xì)胞中關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平（圖15）。值得注意的是，MAT降低了AKT1、ERBB2、MMP2、MMP9、HSP90AA1、HIF1A和IGF1R的mRNA水平、同時(shí)增加了PTEN的表達(dá)，PTEN是PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子。表皮生長(zhǎng)因子受體和METmRNA水平基本不受影響。這些研究結(jié)果支持MAT靶向酪氨酸激酶受體，尤其是ERBB2和IGF1R，并調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路，表明它對(duì)MMP相關(guān)轉(zhuǎn)移性前列腺癌具有潛在療效。

圖15

總結(jié)：本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)+分子對(duì)接+分子動(dòng)力學(xué)模擬+細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選了MAT針對(duì)mPC的治療靶點(diǎn)，闡明了它們?cè)贛AT抗mPC轉(zhuǎn)移潛能中的作用，思路清晰，傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專(zhuān)屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！