題目：單細胞和Bulk-RNA測序揭示了與腦海綿狀血管畸形中銅凋亡相關(guān)的免疫浸潤景觀

英文名：Single-cell and bulk RNA-seq unveils the immune infiltration landscape associated with cuproptosis in cerebral cavernous malformations

雜志：Biomarker Research

影響因子：9.5

發(fā)表時間：2024年6月

研究背景：腦海綿畸形（CCMs）是一種先天性神經(jīng)血管畸形，以散發(fā)性或家族性形式發(fā)生于青壯年。其發(fā)病機制和best治療方法仍不清楚。銅通過引發(fā)細胞增殖、血管生成和代謝，參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在探討銅死亡的分子特征，銅死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡類型，與CCMs的發(fā)展有關(guān)。

研究思路：對15個CCM樣本和6個對照樣本Bulk-RNA數(shù)據(jù)進行了分析，并根據(jù)銅死亡相關(guān)基因（CRGs）的表達水平進行了一致性聚類，將CCM樣本聚類為兩個亞型。然后識別了亞型之間的差異表達基因和免疫浸潤。使用包括LASSO和隨機森林在內(nèi)的機器學(xué)習(xí)算法，篩選出與銅凋亡相關(guān)的CCM的樞紐基因。此外，通過通路富集和相關(guān)性分析，探索了樞紐基因的功能以及它們與CCM免疫表型的關(guān)聯(lián)。然后使用外部數(shù)據(jù)集進行驗證。最后，利用單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)集上的Cellchat算法，我們探索了這些樞紐基因在CCM細胞間通訊中的潛在機制。

圖1

研究結(jié)果：

1、銅死亡相關(guān)基因（CRGs）的表達和腦海綿畸形(CCMs)中免疫浸潤分析

分析了21名患者的表達譜數(shù)據(jù)，其中包括6名對照組患者和15名CCMs組患者（圖2A）共有2963個DEGs，1169個基因上調(diào)，1794個基因下調(diào)（圖2B）。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)基因主要富集在與免疫和血管生成相關(guān)的GO項中（圖2C）。CRGs是來源以前發(fā)表的一篇文章，作者進一步研究CRGs在CCMs差異基因中的表達模式，結(jié)果表明，CDKN2A、GLS、PDHA1和PDHB這四個CRGs在對照組和CCMs組之間表現(xiàn)出明顯的表達差異（圖2D-F）。FDX1和LIAS在CCMs中的表達有所增加，但沒有明顯差異（圖2E、F）。鑒于CCMs中上調(diào)的DEGs主要富集在CCMs的免疫調(diào)節(jié)中（圖2G）。CIBERSORT免疫浸潤表明CCMs中的免疫細胞明顯增多，包括巨噬細胞、樹突狀細胞（DC）、B細胞和T細胞（圖2H）。對CRGs與免疫細胞之間關(guān)系的分析表明，大多數(shù)CRGs與CCR（C-C趨化因子接收器）、T細胞協(xié)同刺激、APC（抗原呈遞細胞）協(xié)同刺激、DCs和Tfh（T濾泡輔助細胞）呈正相關(guān)。在相反，它們與APC協(xié)同抑制、副炎、Treg（調(diào)節(jié)性T細胞）、IIFN型反應(yīng)、TIL（腫瘤浸潤淋巴細胞）、HLA（人類白細胞抗原）和大吞噬細胞（圖 2I）。

圖2

2、基于CRGs表達的CCM聚類分析、功能富集分析

基于共識聚類方法以及篩選的差異CRGs來研究CCMs的銅死亡模式。分析結(jié)果顯示，在k=2時，兩個樣本群集之間的區(qū)別更加明顯，從而建立了兩個不同的群集（圖3A-F）?；鹕綀D被繪制出來以展示兩個群集之間的差異表達基因（DEGs）分布，當(dāng)群集1與群集2比較時，包括281個上調(diào)基因和266個下調(diào)基因（圖3G）。GO富集分析顯示，DEGs主要富集在免疫調(diào)節(jié)、血管發(fā)育和突觸（圖3H）。群集內(nèi)CRGs的表達，并確定了七個表現(xiàn)出差異表達的基因（圖3I）。

圖3

3、與不同亞型CCM相關(guān)的樞紐基因

作者進一步從簇1與簇2、對照組與CCMs中精心挑選了273個交叉DEGs，用于篩選與CRGs聚類的不同亞型CCMs相關(guān)的特征中樞基因（圖4A）。在篩選過程中采用了LASSO回歸和隨機森林算法。如圖4所示，通過LASSO回歸分析確定了14個與CCMs相關(guān)的特征基因。隨機森林算法選擇了一組10個特征基因（圖4D）。然后將這些基因與LASSO回歸算法得到的特征基因相交，最終得到三個重疊基因，即PFDN4、CEMIP和BTBD10（圖4E）。這些基因在接下來的研究中將作為中心基因進行研究。BTBD10和PFDN4在聚類1中表達量很高、而CEMIP在第2組中高表達。此外，這三個基因在CCMs中都顯著過表達（圖4F-G）。此外，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫確定了與CCM相關(guān)的致病基因（圖4H-I)。

圖4

4、CCMs亞型的免疫滲透特征

免疫微環(huán)境主要由免疫細胞、細胞外基質(zhì)、各種生長和炎癥因子以及獨特的理化特征組成。這些因素對CMMs的發(fā)育或出血有重要影響。利用ssGSEA進行了初步分析，通過研究兩個集群與免疫炎癥侵潤之間的相關(guān)性，探討了導(dǎo)致CCMs進展的潛在分子機制。在多種免疫細胞中觀察到了統(tǒng)計差異，包括活化的樹突狀細胞（aDCs）、B細胞、檢查點、DCs、促炎細胞、巨噬細胞、神經(jīng)滋養(yǎng)細胞、漿細胞狀樹突狀細胞（pDCs）、T細胞共同抑制、T輔助細胞、TIL和IIIFN型應(yīng)答組群1和組群2之間，組群2的免疫炎癥水平明顯高于組群1（圖5a）。然后用CIBERSORT算法驗證了ssGSEA的結(jié)果，得出了一致的結(jié)果（圖5a）。值得注意的是，巨噬細胞，尤其是M0和M2型巨噬細胞，在CIBERSORT評估的所有免疫細胞中占很大比例（圖5B-C）。第1組的中樞基因BTBD10和PFDN4與大多數(shù)免疫細胞（包括巨噬細胞和B細胞）呈顯著負相關(guān)（圖5D-F）。相反，第2組的中心基因CEMIP與大多數(shù)免疫細胞呈顯著正相關(guān)（圖5D-E）。

圖5

5、CCMs亞型中免疫系統(tǒng)相互作用的差異分析

從TISIDB數(shù)據(jù)庫中提取了各種免疫因子，并分析了不同免疫因子群的組間差異，包括免疫相關(guān)趨化因子、免疫抑制因子和免疫刺激因子。結(jié)果顯示，趨化因子（C-X-C矩陣）配體9（CXCL9）、趨化因子（C-C矩陣）配體22（CCL22）、趨化因子（C-X-C矩陣）配體12（CXCL12）以及免疫抑制因子顯著上調(diào)、以及免疫抑制因子，包括集群2中的集落刺激因子1受體（CSF1R）、IL10、TGFB1、TGFBR1、CD274和程序性細胞死亡1配體2（PDCD1LG2）。

6、中樞基因的信號通路富集

分析了三個樞紐基因所富集的信號通路，以研究它們影響CCMs進展的潛在分子機制。如圖6所示，TeGSVA結(jié)果表明，BTBD10在高表達時主要激活mTORC1、脂肪酸代謝、刺猬和PI3K-ATK-MTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等信號通路。6A、B表明，CEMIP的高表達主要富集于IL6/JAK/STAT3、血管生成、通過 NFκB的TNFA信號和炎癥反應(yīng)信號通路。同時，PFDN4的表達在膽汁酸代謝、KRAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂肪酸代謝中顯著富集。GSEA分析結(jié)果表明，BTBD10在趨化因子、NOD樣受體和Toll樣受體信號通路中富集（圖6D）。CEMIP在cAMP信號通路、谷氨酸能突觸和逆行內(nèi)大麻素信號通路中富集（圖6E）。PFDN4富集于鈣信號通路、cAMP信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用（圖6F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，樞紐基因可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長、炎癥反應(yīng)、線粒體能量代謝和細胞周期，對CCMs的進展產(chǎn)生重要影響。

圖6

7、人內(nèi)皮細胞中樞紐基因的驗證

考慮到CCMs與血管生成的相關(guān)性，我們選擇了包含ccm內(nèi)皮細胞的RNA-seq數(shù)據(jù)集。以驗證樞紐基因在人內(nèi)皮細胞中的表達和功能（圖7A）。在CCMs_ECs和Control_ECs的比較中，共發(fā)現(xiàn)了149個上調(diào)的DEGs和9,726個下調(diào)的DEGs（圖7B）。發(fā)現(xiàn)上調(diào)的DEGs富集在與免疫調(diào)節(jié)和血管發(fā)育相關(guān)的GO術(shù)語中，與初步分析的結(jié)果一致（圖2C）。在CRGs的表達方面，CDKN2A、FDX1和LIAS在CCMs_ECs組中上調(diào)，而GLS、MTF1和PDHB在Control_ECs組中上調(diào)（圖7D）。因此，CCMs_ECs組似乎表現(xiàn)出更多與杯突變相關(guān)的特征。同時，我們發(fā)現(xiàn)樞紐基因BTBD10、PFDN4和CEMIP在CCMs_ECs中顯著上調(diào)（圖7E）。進一步對CCMs_ECs組的樞紐基因和CRGs進行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在與CRGs的關(guān)系分析中，BTBD10的表達與PFDN4一致，與FDX1、LIAS和DLAT呈顯著正相關(guān)，與GLS和PDHA1呈顯著負相關(guān)（圖7F）。值得一提的是，CEMIP與BTBD10和PFDN4的相關(guān)結(jié)果恰恰相反，與FDX1、LIAS和DLAT呈顯著負相關(guān)，與GLS和PDHA1呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果也與原發(fā)分析中基于CRGs表達的聚類結(jié)果高度一致（圖3I）。

免疫浸潤分析結(jié)果表明，CCMs_ECs組的免疫細胞浸潤較高（圖7G）。與CCMs大體標(biāo)本的初步分析結(jié)果一致（圖2H）。中樞基因與免疫細胞的相關(guān)性分析表明，BTBD10和PFDN4與大多數(shù)免疫細胞呈負相關(guān)，而CEMIP與免疫細胞呈正相關(guān)（圖7H-J）。有趣的是，BTBD10和PFDN4與M2巨噬細胞呈正相關(guān)，而與M1巨噬細胞呈負相關(guān)（圖7H-J）。而CEMIP則顯示出相反的相關(guān)模式（圖7I）。

圖7

8、在HS隊列中驗證中心基因

為了進一步確定這三個樞紐基因在CCMs中的實際表達情況，我們在HS隊列收集的CCMs樣本中進行了免疫熒光共定位并評估了蛋白表達水平（圖8A）。與對照組相比，CCMs組中BTBD10、CEMIP和PFDN4的水平顯著升高，這表明這些樞紐基因在CCMs組織中的功能表達（圖8B-E）。

圖8

9、在單細胞水平驗證樞紐基因

從scRNA-seq數(shù)據(jù)集（GSE155788）中共獲得四個樣本（兩個正常樣本和兩個CCMs樣本）進行分析。這些細胞被分為五種主要細胞類型，包括紅細胞、MΦ/MG、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞（圖9A）。根據(jù)已知標(biāo)記，選擇內(nèi)皮細胞細分細胞亞群，共鑒定出七個內(nèi)皮細胞群，包括動脈、動脈毛細血管、靜脈毛細血管、靜脈毛細血管（Mki67+）、靜脈、頂端細胞和頂端細胞（Mki67+）（圖9B）。隨后的共表達分析表明，群組1中的Btbd10和Pfdn4在CCMs的多個EC中重疊（圖9C）。證明了它們在細胞水平的高水平共表達。群組2的Cemip在CCMs細胞群中的總體表達水平相對較低。亞組分析顯示，Btbd10和Pfdn4在pointed end細胞（Mki67+）中的表達量較高（圖9D）。Btbd10在動脈中高表達，而Pfdn4在靜脈、靜脈毛細血管（Mki67+）和動脈毛細血管中高表達。Cemip在靜脈毛細血管（Mki67+）、頂端細胞和動脈毛細血管中高表達，尤其是在靜脈系統(tǒng)中。隨后，對CCMs不同細胞亞群中的中樞基因和CRGs進行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明這三個中樞基因和CRGs之間的關(guān)系是異質(zhì)性的（圖9E）。

圖9

10、Btbd10通過M2巨噬細胞和pointed end細胞（Mki67+）之間的細胞通訊調(diào)節(jié)CCM的潛在銅死亡機制

接下來的目標(biāo)是研究Btbd10在內(nèi)皮細胞中的高表達是否與CCMs中細胞間通訊的改變相吻合。為此，使用CellChat分析scRNA-seq數(shù)據(jù)中的細胞間通訊。（圖10A）。MΦ/MG與大多數(shù)其他細胞之間的細胞-細胞相互作用強度顯著增強，尤其是MΦ/MG與內(nèi)皮細胞之間，這與我們在大量RNA-seq數(shù)據(jù)集中的觀察結(jié)果一致（圖2H）。隨后，將MΦ/MG分成兩個亞群，即M1和M2，以探討它們與CCMs樣本中高表達樞紐基因的內(nèi)皮之間的相互作用（圖10B）。M2MΦ/MG與Btbd10+內(nèi)皮細胞和Pfdn4+內(nèi)皮細胞之間的相互作用強度強于其他細胞，表明這兩個內(nèi)皮亞群可能在與M2MΦ/MG的相互作用中發(fā)揮主要功能作用。這一發(fā)現(xiàn)與作者在大量RNA-seq數(shù)據(jù)中的分析結(jié)果一致（圖5D-F）。然而，M2MΦ/MG與Cemip+與所有內(nèi)皮細胞相比，Cemip+內(nèi)皮細胞與M2MΦ/MG之間的相互作用較弱，這表明Cemip+內(nèi)皮細胞與M2MΦ/MG之間的相互作用可能不是主要的功能性相互作用。具有高表達中樞基因的內(nèi)皮細胞和MΦ/MG之間有很大可能主要通過多養(yǎng)蛋白（Ptn）與核蛋白（Ncl）的結(jié)合以及fbronectin（Fn1）與整合素alpha4（Itga4）和整合素a1（Itgb1）的結(jié)合進行交流（圖10C）?？紤]到Bdbt10與幾個內(nèi)皮亞群的CRGs之間的正相關(guān)性（圖9），Bdbt10與內(nèi)皮亞群的CRGs之間的正相關(guān)性（圖10E）。我們接著探討了Btbd10+內(nèi)皮細胞與MΦ/MG之間顯著的相互作用路徑（圖10D）。在MΦ/MG和Btbd10+內(nèi)皮細胞之間的相應(yīng)連接對中，相應(yīng)信號通路的受體和配體的表達也有所增加（圖10D）。由于Btbd10在頂端細胞（Mki67+）中的高表達量，Btbd10在頂端細胞（Mki67+）中的高表達量（圖10D）。作者試圖在內(nèi)皮細胞的相關(guān)細胞亞群中探索并驗證Btbd10與銅死亡- Fdx1之間的相關(guān)性。隨后，分析了Btbd10與Fdx1之間的關(guān)系（圖11A）。結(jié)果顯示，在CCMs樣本的pointed end細胞（Mki67+）中，Btbd10與Fdx1呈顯著正相關(guān)，而在對照組中則無明顯相關(guān)性。進一步的共定位結(jié)果也暗示了Btbd10和Fdx1在pointed end細胞（Mki67+）群體中的共表達（圖11B）。M2MΦ/MG，有明顯的相互作用強度（圖11C）。同時，與頂端細胞相比在Btbd10低表達的pointed end細胞（Mki67+）與M2MΦ/MG之間，觀察到相互作用強度顯著增加（圖 11D）。Bdbt10高表達或低表達的M2MΦ/MG和pointed end細胞（Mki67+）之間的配體-受體途徑，發(fā)現(xiàn)它們主要通過Esam（上皮細胞-裂隙粘附分子）-Esam、Col4a1-(Itga1+Itgb1)（膠原Ⅳ型α1鏈-（與integ-rina1相互作用）+Itgb1）和Ptn-Ncl配體途徑相互作用（圖11E）。M2MΦ/MG與pointed end細胞（Mki67+Btbd10-）之間的相互作用主要通過Col4a1-(Itga1+Itgb1)和Ptb-Ncl進行（圖11F）。這些結(jié)果表明，M2MΦ/MG可能通過上述配體-受體途徑與頂端細胞（Mki67+）相互作用，并驅(qū)動頂端細胞（Mki67+）的銅死亡，從而對CCMs的進展產(chǎn)生潛在影響。

圖10

圖11

總結(jié)：9分+生信分析，進行了詳細的分析說明，機制說明，用了多種數(shù)據(jù)集驗證，做簡單的WB/IF驗證，并沒有很復(fù)雜，思路非常值得學(xué)習(xí)！傲星生物提供多種高階方案的影像組生信分析服務(wù)，另有完善的下游驗證、機制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！