題目：多組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示龜齡集通過調(diào)節(jié)花生四烯酸途徑緩解少弱畸形精子癥

英文名：Multi-omics and network pharmacology approaches reveal Gui-Ling-Ji alleviates oligoasthenoteratozoospermia by regulating arachidonic acid pathway

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7/Q1

發(fā)表時(shí)間：2024年10月

研究背景：  龜齡集（GLJ）是一種用于提高男性生育能力的傳統(tǒng)中藥配方。 少弱畸形精子癥(OAT)是導(dǎo)致男性不育的最重要原因之一。龜齡集現(xiàn)在可用于治療少弱畸形精子癥（OAT）。然而，GLJ的活性成分和機(jī)制尚不清楚。

研究思路：首先，建立環(huán)磷酰胺 (CTX)誘導(dǎo)的OAT大鼠模型，評(píng)價(jià)GLJ的療效。其次，進(jìn)行基于血清/尿液的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)和基于組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，以發(fā)現(xiàn)大鼠的差異代謝物和基因。此外，基于多組學(xué)分析結(jié)果構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以探索相關(guān)機(jī)制。最后，使用睪丸間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（TM3）的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證活性成分和關(guān)鍵代謝途徑。

圖1

研究結(jié)果：

1、GLJ可提高大鼠的精子活力并調(diào)節(jié)血清中的性激素水平

為了評(píng)估GLJ的療效，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間，每天都對(duì)所有大鼠進(jìn)行稱重，并觀察它們的身體狀況。在給藥前的第1天至第14天，各組大鼠的體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，GLJ-L組和GLJ-H組大鼠的毛色、精神狀態(tài)和攝食狀況均正常。本研究采用六磷酸肌醇（IP6）作為陽性對(duì)照藥物。IP組大鼠的精子數(shù)量和活性是OAT組大鼠的1.5倍。如圖2A所示，GLJ能有效減緩CTX引起的體重下降，在CTX進(jìn)行OAT造模后的第15至17天，OAT大鼠的體重明顯下降，而GLJ-L組和GLJ-H組大鼠的體重下降速度明顯慢于OAT造模組。附睪中的精液是OAT最直觀的指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)和分析。圖2（B和C）顯示，OAT大鼠的精子數(shù)量和活力明顯減少，而GLJ大鼠的精子數(shù)量和活力則明顯增加。此外，OAT大鼠血清中的黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和睪酮（T）水平明顯降低，但使用GLJ治療后有所改善（圖2D-F）。如睪丸切片HE染色（圖2G-I）所示，OAT組（OAT vs. Sham）的曲細(xì)精管形態(tài)紊亂，管腔內(nèi)的生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少。隨后，OAT大鼠的曲細(xì)精管萎縮和生精細(xì)胞數(shù)量的減少在使用GLJ-H治療后得到緩解。

圖2

2、大鼠血清和尿液的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析

通過分析OAT和GLJ引起的內(nèi)源性差異代謝物（DMs），在尿液和血清樣本中分別鑒定出106種和85種內(nèi)源性DMs，這些DMs在兩組之間的分布如圖3（A和B）所示。

此外，還繪制了反映體內(nèi)含量變化的熱圖。如圖3（D和E）所示，代謝組學(xué)確定的88種DM（尿液中有37種DM，血清中有51種DM）受GLJ調(diào)節(jié)。血清樣本中65%受調(diào)控的代謝物是脂質(zhì)代謝物。因此，對(duì)血清進(jìn)行了脂質(zhì)組分析，確定了159種脂質(zhì)DMs（圖3C），54種受GLJ調(diào)控的DMs的熱圖結(jié)果見圖3F，其中包括33%的甘油磷脂、20%的甘油脂類、17%的類固醇、6%的鞘脂類等。在這些DM中，OAT組的AA水平明顯高于Sham組，而GLJ-L組和GLJ-H組則明顯低于OAT組。同時(shí)，與AA相關(guān)的脂質(zhì)DMs（即PGE2、PGE2a、白三烯E4、12-HETE）在GLJ-L組和GLJ-H組明顯升高。

圖3

3、DM的功能分析

圖4A顯示，鞘脂代謝在所有3組的DMs中都富集，而甘油磷脂代謝和不飽和脂肪酸生物合成的通路在OAT vs. Sham組或GLJvs.OAT組的DMs中富集。發(fā)現(xiàn)了四條通路，包括鞘脂代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝和醚脂代謝（圖4B）。接著，由四條途徑和與途徑相關(guān)的DMs組成的四個(gè)連接模塊構(gòu)成了一個(gè)代謝物-途徑網(wǎng)絡(luò)（圖4C）。該網(wǎng)絡(luò)中的8個(gè)DMs在OAT組和GLJ組中有相反的表達(dá)（圖4D），其中7個(gè)代謝物在OAT處理后增加，而在GLJ處理后則下調(diào)，尤其是花生四烯酸和鞘磷脂。在OAT組和Sham組中，有3條途徑被富集（圖4E），其中DM在11條途徑中發(fā)揮了關(guān)鍵作用（圖4F）。對(duì)包括5個(gè)連接模塊的DMs途徑網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析（圖4G），在該網(wǎng)絡(luò)中，只有一種代謝物在OAT組與Sham組和GLJ組與OAT組中有相反的表達(dá)。如圖4H所示，去甲腎上腺素在OAT組中增加，而在GLJ-L組中減少。GLJ可能通過調(diào)節(jié)去甲腎上腺素來提高男性生育能力。

圖4

4、大鼠睪丸差異表達(dá)基因的鑒定和功能分析

為了闡明GLJ治療大鼠與未治療大鼠之間基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，最終確定了305個(gè)DEGs。將OAT組與Sham組和GLJ組與OAT組中相反表達(dá)的23個(gè)DEGs（圖5a和B）輸入STRING進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)這些基因富集了3個(gè)通路，這些通路與免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)的生物過程有關(guān)。并進(jìn)行了GO、KEGG分析（圖5C-E）。

圖5

5、多組學(xué)結(jié)果和GLJ潛在靶標(biāo)的綜合網(wǎng)絡(luò)分析

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合分析,得到GLJ基因-代謝物網(wǎng)絡(luò)（圖6A）。篩選確定了前30條通路（圖6B），包括內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和脂質(zhì)代謝（內(nèi)分泌抵抗、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和類固醇激素生物合成等）。構(gòu)建GLJ基因-DM網(wǎng)絡(luò),分析DM與OAT中GLJ的治療密切相關(guān)的調(diào)控基因（圖6C-D）。然后，將目標(biāo)得分定義為藥材與藥材配對(duì)的數(shù)量。12個(gè)重要靶標(biāo)的靶向得分如圖6E所示。建立了"藥材-成分-關(guān)鍵分子-途徑"網(wǎng)絡(luò)（圖6F）。在19個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中，花生四烯酸是網(wǎng)絡(luò)中最重要的代謝物節(jié)點(diǎn)。因此，預(yù)計(jì)花生四烯酸代謝在GLJ治療OAT的過程中具有關(guān)鍵作用。

圖6

6、GLJ及其成分對(duì)睪酮分泌的影響

如圖7（A-F）所示，GLJ以濃度依賴性的方式顯著提高了睪酮分泌水平。在所測(cè)試的八種化合物中，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素（psoralen）對(duì)睪酮分泌的影響maximum，在5μM時(shí)就能顯著增強(qiáng)睪酮分泌，而異甘草苷（isoliquiritin）、人參皂苷Ro（ginsenoside Ro）、甘草素（liquiritigenin）和異補(bǔ)骨脂素（isopsoralen）也能顯著提高T水平（在25μM時(shí)，T水平highest可達(dá)0.448±0.041ng/mL）。至于淫羊藿苷（liquiritin）、異補(bǔ)骨脂素（icariin）和熊果酸（ ursolic acid），淫羊藿苷（liquiritin）對(duì)T水平的影響有限，而異補(bǔ)骨脂素（icariin）和熊果酸（ ursolic acid）對(duì)TM3具有抗增殖特性。

圖7

7、花生四烯酸（AA）代謝參與睪酮分泌

如圖7H-I所示，10-M-M的AA在處理3h和24h后極大地促進(jìn)了TM3中睪酮分泌，但在處理3h和24h之間睪酮分泌沒有顯著差異。而且，GLJ（80ng/ml）可以促進(jìn)AA的這種作用。圖7J顯示，單獨(dú)使用GLJ（80ng/ml）可顯著增加TM3的睪酮分泌，而阿司匹林（25μM，環(huán)氧化酶抑制劑）可顯著降低GLJ的促進(jìn)作用，抑制率為50%。與單獨(dú)使用阿司匹林相比，聯(lián)合使用阿司匹林和齊留通（25μM，脂氧合酶抑制劑）對(duì)GLJ的刺激具有相似的抑制作用。因此，加入阿司匹林后，GLJ對(duì)TM3分泌睪酮的促進(jìn)作用明顯受到抑制，而齊留通則沒有。此外，給予AA、阿司匹林和齊魯妥對(duì)TM3細(xì)胞的增殖沒有有害影響。

總結(jié)：本文采用多組學(xué)+網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，揭示GLJ對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的OAT大鼠具有療效，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝紊亂。花生四烯酸代謝可能是一個(gè)關(guān)鍵途徑，而六個(gè)原型化合物是GLJ的潛在關(guān)鍵活性成分。傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！