題目：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探索諾米林對三陰性乳腺癌的治療效果和潛在機(jī)制

英文名：Integrating network pharmacology, molecular docking and experimental verification to explore the therapeutic effect and potential mechanism of nomilin  against triple-negative breast cancer

雜志：Molecular Medicine

影響因子：6

發(fā)表時(shí)間：2024年9月28日

研究背景：諾米林是一種檸檬類化合物，具有抗炎、抗肥胖、抗氧化、抗破骨細(xì)胞生成、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)和解毒等多種生物效應(yīng)，但其在三陰性乳腺癌（TNBC）中的作用仍不清楚。本研究旨在揭示諾米林對TNBC的潛在治療作用，并闡明其作用的具體機(jī)制。

研究思路：采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）、差異表達(dá)分析和GeneCards數(shù)據(jù)庫來確定TNBC的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，利用Swiss Target Prediction、ChEMBL和STITCH數(shù)據(jù)庫確定了諾米林的潛在靶點(diǎn)。通過蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析、分子對接和富集分析，預(yù)測了諾米林對TNBC的核心靶點(diǎn)和作用機(jī)制。最后，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果。

研究結(jié)果：

1、獲得諾米林治療TNBC的潛在靶點(diǎn)

對TNBC隊(duì)列樣本進(jìn)行了差異表達(dá)分析，共獲得9308個(gè)DEGs。WGCNA分析確定了TNBC腫瘤特征的特定模塊，其中MEturquoise模塊與TNBC腫瘤表型的相關(guān)性highest，從該模塊中提取了12524個(gè)基因（圖1A）。然后，從GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出3472個(gè)與TNBC相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。將三種分析方法得到的潛在靶點(diǎn)組合成一個(gè)維恩圖（圖1B），共得到17204個(gè)TNBC潛在靶點(diǎn)。隨后，利用Swiss Target Prediction、ChEMBL和STITCH數(shù)據(jù)庫，確定了301個(gè)諾米林的潛在靶標(biāo)（圖1C）。將301個(gè)諾米林靶點(diǎn)與17204個(gè)TNBC相關(guān)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行交叉分析，發(fā)現(xiàn)有221個(gè)交叉點(diǎn)為諾米林針對TNBC的潛在靶點(diǎn)（圖1D）。此外，還利用Cytoscape構(gòu)建了諾米林抗TNBC的藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

圖1

2、建立PPI網(wǎng)絡(luò)和識(shí)別核心靶點(diǎn)

為了確定諾米林對TNBC的主要作用，利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了一個(gè)由219個(gè)節(jié)點(diǎn)和562條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2A），共確定了8個(gè)核心靶標(biāo)：BCL2、Cas-pase3、CyclinD1、表皮生長因子受體、HSP90AA1、KRAS、PARP1和TNF（圖2B）。圖2C描述了八個(gè)核心靶標(biāo)與其他靶標(biāo)之間的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

圖2

3、分子對接分析和動(dòng)力學(xué)模擬

通過分子對接評估諾米林與已確定的八個(gè)核心靶標(biāo)之間的潛在結(jié)合。使用PyMol軟件對結(jié)果進(jìn)行了可視化（圖3A-H）。諾米林與BCL2、Caspase3、CyclinD1、表皮生長因子受體、HSP90AA1、KRAS、PARP1和TNF的結(jié)合能分別為-6.74、-8.14、-8.29、-6.97、-8.45、-9.28、-7.67和-6.94 kcal/mol。值得注意的是，重復(fù)三次的結(jié)果一致表明，諾米林與所有八個(gè)核心靶標(biāo)的結(jié)合能均低于-5 cal/mol。這表明其具有良好的結(jié)合活性。此外，作者還進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬來評估諾米林之間靶點(diǎn)結(jié)合的穩(wěn)定性。根均方偏差（RMSD）的軌跡顯示，諾米林與BCL2、CYCLIND1、EGFR、HSP90AA1、PARP1和TNF的結(jié)合始終保持一致的穩(wěn)定性，這表明諾米林對這些目標(biāo)具有很強(qiáng)的結(jié)合親和力。

圖3

4、諾米林與核心靶標(biāo)的蛋白質(zhì)組芯片分析

作者使用了包含約20000個(gè)人類全長蛋白質(zhì)的蛋白組芯片，來評估諾米林與核心靶標(biāo)的結(jié)合親和力，并用Cy5-SA對由此產(chǎn)生的結(jié)合情況進(jìn)行可視化檢測（圖4A）。圖4B顯示了結(jié)果的一個(gè)子集，圖4C則提供了描述諾米林與其核心靶標(biāo)相互作用的放大圖像。結(jié)果表明，諾米林與其核心靶標(biāo)之間具有很強(qiáng)的結(jié)合親和力。

圖4

5、功能富集分析

為了闡明諾米林治療TNBC所涉及的關(guān)鍵生物過程，進(jìn)行了GO富集分析（圖5a-B），發(fā)現(xiàn)8個(gè)核心靶標(biāo)主要與類似泛素蛋白連接酶的蛋白質(zhì)結(jié)合、泛素蛋白連接酶和磷酸酶結(jié)合等反應(yīng)有關(guān)。同時(shí)，對細(xì)胞成分的分析表明，與細(xì)胞核包膜、核膜和細(xì)胞下部有關(guān)的反應(yīng)比較集中。此外，中頻分析強(qiáng)調(diào)了相關(guān)靶標(biāo)參與對輻射、光刺激和神經(jīng)元死亡的反應(yīng)。為了研究與這8個(gè)主要靶標(biāo)相關(guān)的信號(hào)通路，進(jìn)行了KEGG富集分析（圖5C-D）。結(jié)果表明，與這些中心目標(biāo)密切相關(guān)的信號(hào)通路包括結(jié)直腸癌、前列腺癌、通過受體激活的化學(xué)致癌物、癌癥中的微量核糖核酸、PI3K-Akt信號(hào)通路、內(nèi)分泌治療抗藥性、細(xì)胞凋亡和雌激素通路。研究結(jié)果清楚地表明了諾米林的抗腫瘤作用與這些通路之間的密切聯(lián)系。其中，PI3K/Akt通路是富集基因數(shù)量最多的通路之一，它可能在介導(dǎo)諾米林抗腫瘤壞死細(xì)胞作用方面發(fā)揮了重要作用。

圖5

6、諾米林可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞系（TNBCCs）的增殖

為了評估諾米林抑制TNBCCs的細(xì)胞增殖潛力，利用CCK-8測定了不同濃度的諾米林處理后TNBCCs的細(xì)胞通透性。圖6A-B所示的結(jié)果表明，諾米林對TNBCCs增殖的抑制作用呈濃度依賴性。根據(jù)CCK-8的結(jié)果，選擇150 μM和300 μM的濃度進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。姜黃素（80 μM）用作陽性對照?？寺⌒纬稍囼?yàn)表明，與對照組相比，用150 μM和300 μM的諾米林處理后，TNBCCs菌落數(shù)明顯減少（圖6C-E）。Western印跡分析以評估TNBC細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。如圖7F-H所示，諾米林顯著抑制了TNBCCs中PCNA的表達(dá)。這些結(jié)果共同表明，諾米林可以劑量依賴性地抑制TNBCCs的增殖。

圖6

7、諾米林可抑制TNBCCs遷移

作者進(jìn)行了傷口愈合和Transwell試驗(yàn)，以研究諾米林對TNBCCs遷移的潛在抑制作用。圖7A-D表明，未經(jīng)處理的MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞顯示出很強(qiáng)的遷移能力，而諾米林處理則會(huì)顯著抑制這些細(xì)胞株的遷移，而且遷移能力的強(qiáng)弱與濃度有關(guān)。此外，還為了觀察到的諾米林對TNBC遷移的抑制作用是否與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)，使用諾米林后評估了EMT標(biāo)記蛋白的水平。圖7E-H描述了WB結(jié)果，顯示由于諾米林的顯著作用，E-cadherin明顯上調(diào)，Vimentin下調(diào)。綜上所述，這些研究結(jié)果表明，諾米林可通過抑制EMT來減輕TNBCCs的遷移。

圖7

8、諾米林在TNBC細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體依賴性凋亡

與抗腫瘤壞死細(xì)胞作用相關(guān)的諾米林富集在細(xì)胞凋亡途徑中。此外，研究還發(fā)現(xiàn)諾米林與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子Cas-pase3具有很強(qiáng)的結(jié)合活性。在此基礎(chǔ)上，研究諾米林是否能誘導(dǎo)TNBCCs的細(xì)胞凋亡。圖8A-B中描述的結(jié)果表明，經(jīng)諾米林處理后，兩種TNBCC中的細(xì)胞凋亡率均顯著上升，晚期凋亡和壞死細(xì)胞的比例明顯增加。凋亡的激活是由Caspase3的裂解形式對靶細(xì)胞蛋白的裂解介導(dǎo)的。免疫熒光分析表明，裂解的Caspase3的亮度明顯增加。圖8C-D，這與免疫印跡的結(jié)果一致（圖8E-H）。此外，之前的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明，BCL2也是諾米林抗擊TNBC的核心靶標(biāo)之一，具有很強(qiáng)的結(jié)合活性。WB分析結(jié)果表明，服用諾米林可抑制BCL2的水平，同時(shí)增加BAX的水平，這表明諾米林誘導(dǎo)的TNBCCs凋亡依賴于線粒體。

圖8

9、諾米林對PI3K/Akt通路的影響

KEGG的研究結(jié)果表明，諾米林可能通過介導(dǎo)PI3K/Akt通路對抗腫瘤壞死細(xì)胞產(chǎn)生重要影響。隨后，對諾米林在調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路中的作用進(jìn)行了全面研究。定量WB分析顯示，諾米林可降低TNBCCs中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)，而PI3K和Akt的表達(dá)則不受影響（圖9A-D）。Akt能夠使mTOR磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的上調(diào)，并促進(jìn)從G1期向S期的過渡。因此，作者評估了諾米林對CyclinD1表達(dá)的影響。與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)一致，WB結(jié)果顯示諾米林有效地抑制了CyclinD1的表達(dá)。綜合這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)了諾米林通過PI3K/Akt/CyclinD1通路發(fā)揮其抗TNBC效應(yīng)。

圖9

10、諾米林可抑制TNBC異種移植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長

如圖10A-C所示，與對照組相比，經(jīng)諾米林治療的裸鼠的腫瘤體積和質(zhì)量明顯縮小。此外，經(jīng)HE染色證實(shí)，諾米林沒有明顯毒性（圖10D）。腫瘤組織的H&E染色顯示腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制（圖10E）。此外，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，諾米林可上調(diào)BAX和裂解-Caspase3的表達(dá)，表明諾米林可通過線粒體依賴途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡（圖10E-G）。從機(jī)理上講，免疫組化結(jié)果表明，諾米林降低了p-Akt的水平（圖10H）?？傊?，這些研究結(jié)果表明，諾米林可有效抑制體內(nèi)腫瘤的生長，并具有良好的安全性。

圖10

總結(jié)：該研究first利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、蛋白質(zhì)組芯片和實(shí)驗(yàn)證實(shí)等方法，有效地發(fā)現(xiàn)了諾米林抗擊 TNBC 的目的和機(jī)制，為治療 TNBC 帶來了希望。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是藥物研究的神器，研究套路完善，有深度，非常值得模仿！